(DNA的提取与鉴定.docVIP

　一、目的　　随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组 southern 　　分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 　　的性质。　　二、原理　　细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 　　时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 　　与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L 　　NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 　　浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 　　制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。　　关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：　　1． CTAB 法：　　CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：　　是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L 　　NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 　　与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。　　2． SDS 法：　　利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 　　与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 　　为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 　　倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 　　的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 　　的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。　　几乎所有的DNase 　　都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA 　　处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA 溶液转移时用大口（或剪口）吸管。提取的DNA 　　是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”（melting temperature, 　　Tm）测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB 法提取DNA 并通过紫外吸收法鉴定。　　三、实验材料、主要仪器和试剂　　1．实验材料　　新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等　　2．主要仪器　　（1）高速冷冻离心机　　（2）751 型分光光度计　　（3）恒温水浴　　（3）液氮或冰浴设备　　（4）磨口锥形瓶　　（5）核酸电泳设备　　3．试剂（CTAB 法）　　（1）CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L 　　EDTA-Na2，1.4mol/LNaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。　　表1 CTAB提取缓冲液配制　　　　用HCl 调pH 值。　　（2）TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA（ pH8.0）。　　（3） DNase-free RNase A: 溶解RNase A 于TE 缓冲液中，浓度为10mg/mL，煮沸10～30min, 除去DNase 　　活性，－20℃贮存（DNase 为DNA 酶，Rnas