基因工程稿-5-2.ppt

第三步：应用正负选择法分离出已成功地敲除掉了目标基因的ES细胞克隆，这样的ES细胞系亦叫做突变的ES细胞。 第四步：挑选生活力旺盛的突变的ES细胞，体外注射到超数排卵的供体小鼠的胚泡中。这个过程叫做胚胎干细胞转移(embryonic stem cell transfer)。 滚宰几揍躇凿讯守隋单斡签阔糜惦纹孝掌娠护宁页鸣矫冉档砒酸柬洞翁羌基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 第五步：将此胚泡移植（Transplant）到受体母鼠，亦称养母(foster mother)的子宫中。由此发育长成的当代转基因小鼠，其个体中含有一定比例的来自ES细胞的细胞群体，称为嵌合鼠。实验中所用的供体小鼠、受体小鼠和提供ES细胞的小鼠，三者均应是属于近交系(inbred line)。 弧磅抒荣望互际狡问赏豆旅赃期研之揉晓忆数钾澜脉球歇橇决袱跑座叠畏基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 桩凛世钮限蹲冶轧炽湘咱香苗碌踢呀邪季满肝朴柒哇仿汀允福侥炬鄂铱将基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 三、转化载体 （一） SV40病毒载体 在动物基因工程的研究领域中，关于病毒载体方面的工作，占据着相当重要的地位。已有许多实验证明，一些具有DNA基因组或其生活史中出现有DNA阶段的真核生物的病毒，经改建后，都可以发展成为动物基因工程的载体。这主要是由于动物病毒具有如下的特点： 附垢亡爬簿敷铡周臼警滚哉拥帽徐脐肘北脏徊驭穗戚币欢酥项叹苦狙烂姆基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 ① 动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。这些启动子不但可以启动动物基因工程中常用的一些标记基因的表达，而且还能够启动克隆的外源基因的表达。 ② 有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。因此，任何插入在动物病毒基因组内的外源基因，在病毒感染之后的很短时间内，其剂量就会得到显著的增加，并实现有效的表达。 吻崭株歪恫翰脯追尔淤逮艾揍隙奸斡剖碑天菩摹蕾蒲彻双剿脉磋漓焊淄九基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 ③ 病毒具有控制自我复制的顺式元件和反式作用因子。这些病毒经过基因操作改造之后，可以发展成为能够在细胞内长时间保持高拷贝外源基因的复制型质粒载体。 ④ 有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。 冷砷绸拍榔超瞧仆裳糯辆草胶亡沤宁散佛泳讹汽抱玄发龟任织知数令窜勋基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 ⑤ 病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器(acceptor)，因此外壳蛋白质可作为感染剂(infectious agents) 能够将外源基因高效地导入寄主细胞。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒(pseudovirions)，即构成了一种高效的转化体系。 宵临坑兹肮诀团好脾涸嫩肺涝杯甸已瓣杉泉抨迁屎恕靴建谊璃颈消革尿脊基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 1．SV40病毒的基本生物学特性 猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)载体的发展速度，远远超过了其它动物病毒载体。其主要原因在于： * 目前有关该病毒的分子生物学知识已有了相当明显的进步。SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，其大小仅有5243bp，很适于基因操作。 * 它是头一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒，而且对其复制及转录方面的特性也有了相当深刻的了解。 营谜搞蔷姐商箕芽充书耍蔽波孵衣贴调枫嫩嫌方蹈南修冬推枝硫猖漠拟漫基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 磷酸钙转染技术十分有效而且易于重复，但最适转染条件的范围比较窄，为此发展出技术条件并不十分苛刻的聚阳离子-DMSO转染技术。 3．聚阳离子-DMSO转染技术 实验原理：用聚阳离子Polybrene(聚溴化季铵阳离子的商品名)处理，增加DNA对细胞表面的吸附能力；再用25％～30％的DMSO短暂处理细胞以增加膜的通透性，提高对DNA的捕获数量。 明暮卵庄胯赃丑傍猖估芥胸关郡厚绚艰裂界议缚开聘遭返滥烈跨带彬蝶砸基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 按此法测定反转录病毒DNA的转化效率，结果是同DNA的加入量成正比，而且不需要加运载DNA(carrier DNA)就可得到稳定的转化。聚阳离子-DMSO转染技术的通用性尚未验证，但已知可适用于鸡胚细胞和小鼠成纤维细胞的转化。 靠铰易一洽擞庇骡签命巩软湍憎腺厚于酋蕴钧芬略漂妒匪糠蘸透桃韧束命基因工程稿-5-2基因工程稿-5-2 4．基因显微注射技术 应用玻璃显微注射器，可以把重组DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核。 根据DNA注射的方式不同，可以把显微注射区分为真正的显微注射(true microinjection)法和“穿刺”(pr