原核参考表达及纯化总结.docVIP

His标签重组蛋白大量表达及纯化 筛选及鉴定 将构建好的连接产物进行转化DH5α 鉴定 表达载体和目的片段的连接一般为10μL连接体系，此步转化方法如下： 取100μL DH5α感受态细胞，加入到10μL连接产物体系中 ↓ 冰上放置30min ↓ 42℃准确热激90秒 ↓ 冰上放置3min ↓ 加入300μL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h ↓ 将400μL菌液全部涂LB平板（含Amp+）水平放置30 min待菌液完全吸收后， 在37℃温箱中倒置培养过夜（12~16 h），直至出现单菌落。 2阳性克隆的PCR鉴定方法如下 挑取单菌落于200μL含Amp+LB培养基中（用2.0的离心管）摇床200rpm/min37℃培养4h待菌液浑浊后，取1μL做菌PCR鉴定PCR扩增体系如下： 取1 μL菌液作为模板 反应体系如下： 模板 1 μL 10×PCR反应缓冲液（含Mg2+ ） 2 μL dNTP(2.5 mmol/L/each) 1.6 μL 上游引物（10 μmol/L） 1 μL 下游引物（10 μmol/L） 1 μL Taq酶（5 U/μL） 0.3 μL ddH2O 13.1μL Total 20 μL 条件： 94℃预变性 10min 94℃变性 45s 50℃退火 45s 72℃延伸 1min，30个循环的扩增反应 72℃延伸 10 min 4℃ ∞ 1% 琼脂糖凝胶电泳检测电泳上样时：Marker DL2000上样3μL 样品1μL loadingbuffer +6μL PCR产物混匀上样 100V，20min；紫外透射仪检测，出现目的带的对应菌落为阳性克隆。 （注意：记得保存菌种） 3阳性克隆质粒抽提 取阳性克隆菌液200μL加3ml含Amp+ LB培养基，37℃ 200rpm/min培养3-4h，待菌液浑浊后质粒抽提。 质粒抽提方法如下： 取1.5mL菌液于1.5mL离心管中 ↓ 12000rpm离心30s，弃上清 ↓ 加800μL STE悬浮沉淀 ↓ 12000rpm离心30s，弃上清 ↓ 重复STE漂洗沉淀的过程 ↓ 加入100μL预冷的solution Ⅰ，强烈振荡混匀 ↓ 温和加入200μL solution Ⅱ（solution Ⅱ现用现配），盖紧管口快速颠倒5次， 放置冰上2 min至溶液清亮而粘稠 ↓ 极温和加入150μL预冷的solution Ⅲ， 倒置温和振荡10s，冰上放置5 min ↓ 12000rpm离心5 min ↓ 取上清（400μL），加入等量的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），振荡混匀 ↓ 12000rpm离心5 min ↓ 取上清（350μL），加入1/10体积（35μL）的NaAc（3M） 和2倍体积预冷的无水乙醇（700μL）上下颠倒5次，（无水乙醇在-20℃保存） ↓ 室温放置20min（-20℃沉淀效果更好） 13000rpm离心10 min↓ 弃上清（小心倒出），用1ml 70%的乙醇贴壁冲洗漂洗沉淀 ↓ 13000rpm离心10min 室温放置让乙醇挥发干净 ↓ 用20μlTE溶解质粒DNA，每20μL体系中加入1μL 1mg/mL的Rnase37℃ 作用30min1%琼脂糖电泳定量检测纯度 所用试剂： STE：0.1mol/L NaCL 10mmol/L Tris-HCL(pH8.0) 1mmolol/L EDTA solution Ⅰ：50mmolol/L Glucose 25mmolol/L Tris-HCL（pH8.0） 10mmolol/L EDTA(pH8.0) solution Ⅱ： 0.2mol/L NaOH 1%SDS 4、solution Ⅲ：5mol/L KAc 60mL 冰醋酸 11.5mL 无菌水 28.5mL (最终K+的浓度为3mol/LAc-的浓度为5mol/L) 4BL21的转化及诱导表达 质粒转化BL21感受态细胞方法如下： 取100μL BL21感受态细胞，加入1μL质粒 ↓ 冰上放置30min ↓ 42℃准确热激90秒 ↓ 冰上放置3min ↓ 加入900μL无Amp+ 的LB培养基，37℃ 100rpm/min振荡培养1h ↓ 取100μL菌液全部涂LB平板（含