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2017-01-31 发布于北京
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(碱基顺序的化学分析法

3.5核酸碱基顺序分析中的化学方法 DNA化学顺序方法于1977年由A.M.Mamamx和W.Gilbert第一次报道，因此又称为M＆G法（化学降解法）。这一方法是将模板DNA的一端标记，之后按碱基顺序逐个地将整个大分子断裂，标记的DNA片段的长度或大小与每个碱基的所在位置相对应，当这些反应产物经过变性聚苯稀酰胺凝胶电泳分离后，其代表的DNA顺序便可以从同位素标记的自显影带形上读出。这项技术可以测出距离标记位点250核苷酸以内的DNA序列。经过多年的努力在模板DNA末端标记和特异性化学反应方面都进行了改进，使这一方法成为DNA序列分析的基本方法。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 化学降解法测序原理在M＆G法测序系统中，一个末端标记的DNA片段在4组或5组互为独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。在这几组反应中通过化学裂解形成的放射性标记的分子具有共同起点——放射性标记末端，而其终点不同——发生化学降解的位点。每组混合物中的含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在待测DNA全长片段中的位置。此后，将各组反应产物进行序列胶高压电压分离，再通过放射自显影显示序列结果。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 原理示意图 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 方法成败的关键一、对特定碱基进行化学修饰二、经过修饰的碱基从糖环上脱落，DNA主链在修饰碱基5 ’和3 ’磷酸二脂键断裂。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. DNA样品的制备待测DNA样品的末端标记单末端标记DNA片段的分离纯化碱基特异化学裂解反应序列胶高压电泳分解读取序列化学法测序的一般流程 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 载体的选择化学法中用的最多的是Messing及其同事构建的pUC系列载体。它们是化学法测序中比较好的载体。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Puc质粒系列图谱 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Psp64/图谱 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. DNA样品的制备 DNA样品必须是来自转化细胞的单菌落，绝对不含有宿主细胞的染色体DNA及其RNA。 1、氯化铯-溴化乙啶梯度平衡离心法纯化质粒DNA。 2、寡核苷酸——从固相支持物上洗脱下的寡核苷酸不具有5’末端磷酸基团。测序前用高压液相柱或电泳技术纯化进行5’末端标记。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. DNA样品的末端标记 Klenow片段酶介导的标记反应 1.在一支微量离心管中加入