【2017年整理】浙江大学细胞培养-基础知识.pptVIP

一、细胞培养物的生长生物学 （一）贴附(粘附)型细胞 粘附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式 含义：细胞与细胞间接触，细胞与细胞外基质结合。 结果：细胞与细胞之间相互结合形成组织，使细胞与其周围环境间始终保持联系，使有机体内几乎不存在“自由”的细胞。 培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。 （二）悬浮生长型 概念 培养时不贴附于基质而呈悬浮状态生长，或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源 自血，脾或骨髓，尤其血中白细胞，癌肿细胞也可能 特点 在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团 一代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 2.1 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10 min-4 h 2.2 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟--4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 2.3 潜伏期： 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24 h。 培养基的基本要求 培养基的种类 培养基的选择 培养基的配制 制备1000 ml RPMI-1640培养基 RPMI?1640?干粉培养基10.4 g（1包） +蒸馏水?400 ml ↓　 磁力搅拌至完全溶解? ↓　 加三蒸馏水定容至1000 ml ↓ 滤过除菌，并分装成200 ml/瓶，-20 ℃冻存 酚 红 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示(黄--红--紫) 0.4％酚红溶液：称取0.4 g酚红，置玻璃研钵中细研，逐滴加入0.1 mol/L NaOH边滴边研至酚红完全溶解，记好加 NaOH的量，共加11.28 ml，将研好的酚红液用吸管移入烧瓶中加三蒸水88.72 ml，高压灭菌。 在一些特殊培养液中不含酚红 哺乳细胞培养液：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用 流式检测细胞培养液：酚红干扰检测 维持液与生长液 维持液：合成培养基中不加血清或加低浓度（如 2％）血清，仅能维持细胞生存，细胞不能很好生长。 生长液：合成培养基中加入10-20％血清，有利于细胞生长。 ［附］ RPMI-1640生长液和维持液配法 其它培养用液 几种常用的平衡盐溶液的配方 (g/L) 常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%） 称取所需胰蛋白酶，用少许D-Hanks液调成糊状 再补足D-Hanks液，搅拌混匀，置室温4 h或冰箱过夜，不断搅拌振荡 次日，滤过除菌，分装， -20 ℃冻存 消化液-- EDTA·2Na 溶液 一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长 EDTA 溶液配制：用D-Hanks 液溶解后，高压蒸汽灭菌，小瓶分装，4 ℃保存 pH调整液 为了营养成分稳定和延长贮存时间，在配制营养液时一般不预先加入NaHCO3，而在使用前再加入。故NaHCO3都是单独配制，高压灭菌。 此外，为了维持培养液恒定的pH，以利于细胞的生长和增殖，还可利用Hepes强缓冲液。 pH调整液--- NaHCO3 溶液 常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，滤过除菌或高压灭菌，分装，4 ℃保存 调节pH时，NaHCO3要逐滴加入，并不时摇动培养液，以防止加入过量。当pH值过高后，可用灭菌的10％醋酸溶液或通入CO2气体调节。 pH调整液--- Hepes液 一种弱酸，中文名为4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸，分子式为：C8H18O4N2S，分子量为238.31。 主要作用: 防止培养基pH迅速变动。 使用终浓度一般为10-50 mmol/L 常配成1 M 储存液：用100 ml 双蒸水溶解23.8 g Hepes，滤过除菌或高压灭菌，分装小瓶，4 ℃保存。使用时可向100 ml培养液中加入1 ml Hepes储存液，终浓度为10 mmol/L 各种抗生素使用情况 无菌室的条件 一定的密闭性 通风透气良好，但不会因此造成室内污染 适合于消毒 方便进出但不会因此而影响无菌室的“无菌性”，保证工作空间的“绝对”无菌 一般包括：准备室、培养室和缓冲室 无菌室内的设备 超净工作台，CO2培养箱，倒置显