第三章理化检测(食用菌粗蛋白杂质)全解.ppt

VC检测技术 2，4-二硝基苯肼法 （GB第二法） 3、注意事项 （1）试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。 （2）活性C—氧化剂+脱色剂（深色样品） 无色或已脱色样品—溴或2，6二氯靛酚作氧化剂 （3）硫脲的加入—防止VC继续被氧化 促进脎的形成 食用菌中杂质检测 食用菌中蛋白质检测 测定蛋白质的方法可分为两大类 利用蛋白质的共性，即含氮量（16%） 、肽键测定蛋白质含量 ； 利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。 具体测定方法 凯氏定氮法 水杨酸比色法、紫外分光光度法、双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法、红外光谱 蛋白质含量测定最常用的方法是凯氏定氮法 食用菌中蛋白质检测 凯氏定氮法 测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数（1/16%）而求出蛋白质的含量 为粗蛋白含量（含有少部分含N非蛋白核酸、生物碱等） 1833年Kieldahl首先提出 常量K氏定N法 微量K氏定N法 自动K氏定N法 半微量K氏定N法、改良法等 食用菌中蛋白质检测 1、原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解 碳和氢被氧化为CO2和H2O逸出 有机氮转化为氨，与硫酸结合成硫酸铵 常量K氏定N法 硫酸铜作催化剂—常量、微量、半微量 硫酸铜+二氧化钛—改良 ?2NH2(CH2)2COOH+13H2S04?→?? (NH4)2S04+6C02+12S02+? 16H2O 食用菌中蛋白质检测 1、原理 常量K氏定N法 加硫酸铜 催化剂 指示消化终点：溶液为蓝绿色（硫酸铜溶液颜色），清澈透明 加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度 蒸馏时碱性反应的指示剂（判断加碱量是否足够） C+CuSO4 →Cu2SO4+SO2+CO2 Cu2SO4+2H2SO4 →2CuSO4+2H20+SO2 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色而不成褐色（氢氧化铜沉淀、CUO沉淀、铜离子与氨的络合物），此时需再增加氢氧化钠用量。 食用菌中蛋白质检测 常量K氏定N法 ?2NH2(CH2)2COOH+13H2S04?→?? (NH4)2S04+6C02+12S02+? 16H2O 消化 一定是浓硫酸： 浓硫酸具有脱水性 使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮 浓硫酸又具有氧化性 2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫 H2SO4＋2NH3 ＝ (NH4)2SO4 加硫酸钾 增温剂，提高溶液沸点（330→400） 浓硫酸酸性 食用菌中蛋白质检测 1、原理 用硼酸吸收氨 以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。 常量K氏定N法 整个过程：消化、碱化、蒸馏、吸收、滴定 2NH3+4H3BO3 →(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B407+H2S04+5H20 → (NH4)2SO4+4H2BO2 加碱蒸馏，使氨蒸出 (NH4)2SO4+2NaOH→2NH3+2H2O+Na2SO4 食用菌中蛋白质检测 2、仪器与试剂 （1）通风橱 （2）消化装置 （3）蒸馏装置 （4）盐（硫）酸标准溶液 配制、标定 （5）奈氏试剂——〔Nessler试剂，K2（HgI4）〕 常量K氏定N法 3.5 g KI + 1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。 溶解11.5 g HgI2 + KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。 食用菌中蛋白质检测 3、实验步骤 （1）消化 常量K氏定N法 5克样品 +10克结晶硫酸钾 +l克硫酸铜 +浓硫酸25毫升 小火加热 保持和缓的沸腾 使火力集中在凯氏瓶底部 （以免溅附在壁上的蛋白质处于无硫酸存在的情况，使氮有损失。 ） 液体为蓝绿色透明 继续加热微沸1h 冷却 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上.(用水冲洗) 消化时如不呈透明溶液，可放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶， 利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下 促进其消化完全 食用菌中蛋白质检测 3、实验步骤 （2）蒸馏、吸收 常量K氏定N法 B 25毫升硼酸吸收液 甲基红—溴甲酚绿混合指示剂 下端插入液面下 40℃（可放在冷水浴中） A少量水、消化液