抗体工程,蛋白质工程- 图文.pptVIP

抗体工程 (Immune Engineering) 第一节 单克隆抗体 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体 如何大量生产单克隆抗体？ 单克隆抗体的概念： 由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过克隆，形成细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 杂交瘤细胞的筛选(1) 骨髓瘤细胞：为HGPRT基因缺陷型细胞，不能合成DNA。需经应急途径合成DNA。HAT培养基含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶。氨基喋呤可阻断骨髓瘤细胞的应急DNA合成。所以骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中生长存活. B淋巴细胞具有HGPRT基因但不能在体外生长。 利用这两种细胞各自的特点，筛选能在体外含HAT的培养基中生长的融合子。 杂交瘤细胞的筛选(2) 鉴定后的杂交瘤细胞可大规模培养，收集上清提取单克隆抗体，也可免疫小鼠腹腔，抽取腹水来制备相应的McAb，但生产规模和产量均受限制。 单克隆抗体的优势 1．高特异性，针对一个抗原靶点。。 2．高纯度，成份均一，来自一个克隆。 3．高效价，抗体的滴度高。 4．高效益，国际上近100亿美元市场。 5．易制备。 6．前景好，McAb 1995问世后，风糜全球，寄予厚望。 单克隆抗体应用领域 1．McAb作为诊断试剂应用： 这是目前应用最广的领域，目前已有许多成套的诊断试剂盒在诊断传染病，代谢病和免疫性疾病中应用，取得良好经济和社会效益，全世界有上百亿市场。举例：早孕试纸，乙肝诊断试剂盒 2．抗体导向治疗 用特异性单抗为载体，将抗瘤药物、放射性核素以及毒素等毒性物质导向性携带至肿瘤灶局部，可特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞损伤较轻。将毒素与单抗连接常称为免疫毒素。常用的毒素包括植物毒素（如蓖麻毒素、苦瓜毒素等）和细菌毒素（如白喉外毒素、绿脓杆菌外毒素等）。 3．McAb作免疫抑制剂应用，应用于器官移植。 当前McAb最具代表的是抗TNF单抗治疗类风湿和回肠炎有效，有20亿美元市场。其他在抗肿瘤，抗排异及抗血栓方面也很看好。 1980年后，其开发走向下坡路，临床实验失败，股票狂跌，损失以百万美元计。 原因：病人过敏及免疫性疾病加重病人病情，体内很快排异及对肾脏毒性。 但到2000年又有回头，2001年被认为在免疫学上是“单克隆抗体年”，抗体研究将迅速发展，现单在治疗方面就有10种单抗进入市场，3种待批上市，近100种在进行临床试验阶段。当然，与McAb技术改进关系极大。 第二节 鼠单抗人源化 第三节 小分子抗体 第四节 抗体融合蛋白 免疫毒素：又称生物导弹，是由导向性的载体分子（抗体部分）与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。 第五节 噬菌体抗体库技术 二、噬菌体抗体库 运用DNA重组技术把人抗体基因与噬菌体载体DNA相连，在噬菌体表面呈现并制备人类全套抗体的技术。 phage antibody library phage antibody bank 因此,噬菌体抗体库技术 不经免疫 不经细胞融合技术 即可获得含量丰富、种类众多的单一抗体技术。 1．抗体基因的扩增: 利用PCR技术，从外周B淋巴细胞DNA中分别扩增出轻链、重链可变区的基因。 也可从B细胞mRNA中，经逆转录为cDNA后再扩增。 除B细胞外，外周淋巴细胞、脾、淋巴结和骨髓细胞也可选用。 显而易见，此法除了引物设计十分重要外，还要考虑机体免疫状态、细胞种类和数量、mRNA丰度等影响。 引物设计，一般可选： ①　5ˊ端引物选Ig前导肽保守序列，5ˊ 端引物也可选Ig分子骨架区1(FR1)的保守序列。 ② 3ˊ端引物常选J区保守序列。 构建Fab基因库，则在重链绞链区和轻链恒定区设计引物。 ③ 依据抗体基因家族保守序列设计引物。 ④ 设计多套引物分别扩增。 为保证引物与模板最大的匹配，扩增出所有基因，有时尚须采用兼并引物。 2．噬菌体表达载体的构建 选用丝状噬菌体(M13、fd)，其DNA呈单链。 一般在其外壳蛋白基因信号肽序列与编码成熟的蛋白序列之间插入外源基因：人Ig基因片段。用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的cDNA，克隆进入丝状噬菌体载体中，即与外壳蛋白pⅢ 或pⅧ的基因连接形成融合基因。 一般插入后不影响表达系统功能，在此融合基因中，人 Ig 基因片段多位于噬菌体基因的上游5ˊ端，在细菌中可以表达。一般作用的载体都是经过改建的，即含有LacZ启动子、核糖体结合位点(SD序列)、前导肽序列(保证分泌)和多克隆位点等，其后为M13外壳蛋白(pⅢ或