生理试验方法介绍.docVIP

试 验 方 法 王涛 1.SOD（超氧化物歧化酶）：氮蓝四唑法（NBT）法 称0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L，PH＝7.8），冰浴研磨，研磨后再加1.5ml缓冲液，倒入离心管中，再用2.5ml缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（0～4℃）离心20min（10500rpm），离心后冷藏保存。取型号相同的试管，试管中加50μL上清液(2支对照试管中各加磷酸缓冲液50μL)，分别加3ml反应液，其中1支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx日光下反应20～30 min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。反应结束后，以不照光的对照管作空白，于560nm下比色测定吸光度值。 ·磷酸缓冲液配制法： A：（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：Na2HPO4·2H2O35.61g或Na2HPO4·7H2O53.65g或Na2HPO4·12H2O71.64g，蒸馏水定容至1000ml B：（0.2mol/L NaH2PO4溶液）：NaH2PO4·H2O 27.6g或NaH2PO4·2H2O31.21g，蒸馏水定容至1000ml 0.1mol/L缓冲液配法A：x（ml）+B：y（ml）稀释至200ml；0.05mol/L稀释至400ml。 0.1 mol/L x(ml) y(ml) PH 0.05mol/L x(ml) y(ml) PH 12.3 87.7 6.0 61.0 39.0 7.0 84.0 16.0 7.5 91.5 8.5 7.8 91.5 8.5 7.8 94.7 5.3 8.0 ·反应液：水：磷缓：Met：NBT：EDTA-Na2：FD（核黄素）＝5：30：6：6：6：6 150ml反应液组成： 水12.7ml+磷缓76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA-Na215.25ml+FD15.25ml 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：1.9399gMet用磷缓定容至100ml； 750μmol/L氮蓝四唑溶液：0.06133gNBT用磷缓定容至100ml，避光保存； 100μmol/L EDTA—Na2溶液：0.03721g EDTA—Na2用磷缓定容至1000ml； 20μmol/L核黄素溶液：0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 ·计算公式：以抑制NBT光化学还原50%所需酶量为酶活性单位(U) SOD总活性（units·g-1FW）＝(（Ack-AE）*V)/(0.5*Ack*W*Vt) SOD比活力(units·mg-1Pr)= SOD总活性/蛋白质含量 Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（4ml），ml；Vt为测定时样品用量，ml；W为测定时样品重量（0.5g）；蛋白质含量单位为mg/gFW。 2.POD(过氧化物酶)：愈创木酚法 取上清液20μL加入比色杯中（对照加20μL磷缓），加3ml反应液，马上读470nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。 ·反应液：0.1mol/L，PH＝6.0的磷缓50ml，加入愈创木酚28μL，于磁力搅拌器上加热溶解，加入30％H2O219μL存于冰箱中。 ·计算公式：POD总活性(△OD470·min-1·g-1FW)＝（△OD470*V）/(a*W*t) (V=4ml;a=0.02ml;W=0.5g；t＝1min) POD比活力（△OD470·min-1·g-1Pr）＝总活性/蛋白质浓度 3.CAT（过氧化氢酶）： 取上清液100μL加入比色杯中（对照加100μL磷缓），加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每隔1min读一次（读0、1、2、3min的OD值）。 ·反应液：0.1mol/L，PH＝7.0磷缓20ml，加0.1mol/L H2O25ml（5.68ml，30％H2O2定容至1000ml）。 ·计算公式：CAT总活性(△OD240·min-1·g-1FW)＝（△OD240*V）/(a*W*t) (V=4ml;a=0.1ml;W=0.5g) CAT比活力（△OD240·min-1·g-1Pr）＝总活性/蛋白质浓度 4.MDA（丙二醛）： 取上清液1ml（对照加1ml水），加2ml0.67％TBA（硫代巴比妥酸），封口沸水浴15min，迅速冷却（用冷水冲泡），倒入指形管中，4000rpm下离心20min，取上清液于600nm、532nm、450nm下比色。 ·0.67％TBA：称0.67gTBA，