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DNA片段的回收 一. 【实验目的】 掌握转化的原理和方法 掌握T-A克隆的原理 掌握α互补的原理和蓝白斑筛选重组子的原理和方法 二. 【实验仪器与试剂】 实验仪器：恒温摇床、超净工作台、恒温水浴锅、恒温箱、微量取液器等 实验材料：连接试剂盒（PMD19-T、目的片段、SolutionⅠ）、大肠杆菌感受态细胞等 实验试剂：LB固体培养基、氨苄青霉素（Amp）、X-Gal、IPTG等 三. 【实验原理】 1、 连接 是指把外源DNA片段同载体连接起来。 外源DNA片段同载体连接策略如下： a.把载体和DNA片段分别用同一组酶(两种不同的粘性末端限制性内切酶) 进行消化，使各自产生带有非互补的粘性末端，再把二者进行连接。 b.把载体和DNA用一种相同的粘末端酶处理，使各自带有一种互补的粘性末端，再连接。 c.把载体和DNA用平端酶处理，再连接。 2 、转化 指把DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。经过42℃短时间热击处理，促进细胞吸收胞外DNA。然后将细菌放在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ａmpr等）得到表达，最后将此细菌培养物涂在含有Ａmp的培养基上，筛选出含有外源基因的阳性克隆。 3、α互补 pUC19载体构建的pMD 19-T Vec