重组DNA技术--04-13幻灯片.ppt

重组DNA技术 (DNA克隆或分子克隆) DNA Recombination Technique ( DNA Cloning or Molecular Clone) 1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验: (二)目的基因 进行DNA重组的目的主要有两方面： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因(target DNA)。 目的基因有两种类型： cDNA(complementary DNA):在体外经反转录合成的．与mRNA互补的DNA。 基因组DNA(Genomic DNA):代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。 (三)载体 一.表达载体(expression vector): 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二.克隆载体(Cloning vector): 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 常用质粒载体 （一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点： （1）含有复制起始点和复制调节信号； （2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因； （3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于重组体细胞的筛选。 （二） pUC系列载体: 由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点： ①具有更小的分子量和更高的拷贝数。 ② “蓝白斑”筛选: pUC载体中的LacZ′基因可编码β-半乳糖苷酶（β-Gal）N端的α-肽链，该α-肽与宿主细胞(如E.coli JM109）中F′因子上的LacZ′△M15基因（α-肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、有活性的β-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当外源基因插入MCS后，LacZ′α-肽基因的读码框被破坏，不能合成完整的β-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛选。 第五节 目的基因的获取和体外重组 化学合成法：较短的基因（60-80bp） 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 5.T-A克隆 T-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法。 （二）转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法： 磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 :操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。 脂质体转染 :脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。 显微注射:转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧。主要用于稳定表达 （三）感染（infection） 感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组体DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA注入细菌或真核细胞。 感染的效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂的体外包装过程。 4．根据插入的外源基因性状进行筛选 如把酵母基因组DNA随机切割后插入到质粒载体中，然后将重组质粒转化到组氨酸缺陷型大肠杆菌细胞中，并在无组氨酸的培养基中培养。这样只有含酵母组氨酸基因并获得表达的转化菌才能在无组氨酸的培养基中生长。 （四）.PCR法 某些载体的MCS两侧存在保守的序列，如pGEM系列载体的MCS两侧是T7及SP6启动子序列，可根据此序列设计引物，对提取的重组质粒进行PCR扩增。 如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌的质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目的基因的预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落。 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白 真核表达载体大多是穿梭载体, 通常包括以下元件： 1．启动子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。 2．增强子 3．剪接信号 4．终止信号和PolyA化信号 5．遗传选择标记 ：胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。 新霉素抗性选择系统 新霉素的类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的