菌株的应用解析.ppt

标准菌株的应用及保藏技术 上海汉尼生物技术有限公司 缪文俊 市场部 内容提要 前言 菌种保藏机构 标准菌株的应用 实验室适用菌种保藏技术 其它保藏技术 前言 药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。 菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结果的正确性。 药品微生物检验主要考虑其标准性。 各国菌种保藏机构 中国医学微生物菌种保藏中心（CMCC） 美国典型菌种保藏中心（ATCC） 美国北部地区研究实验室（NRRL） 荷兰霉菌中心保藏所（CBS） 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 日本的大阪发酵研究所（IFO） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） 国际微生物学联合会（IAMS） 世界菌种保藏联合会（WFGC） 标准菌株的应用 培养基适用性检查 方法验证 阳性对照试验 抑菌效力检查 能力验证 培养基适用性检查 意义：证实在规定的实验条件下，培养基能支持微生物的生长，那么检品中可能存在的微生物就能在该培养基内或者培养基表面生长，或出现混浊或形成菌落，从而防止出现假阴性保证检测结果的真实性。 菌种：不得超过5代 1 .促生长能力检查 加入一定量的标准阳性菌株菌悬液（菌的数量要求在50-100cfu）至被检培养基和对照培养基平板上，按规定温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征一致。 2 .抑制能力检查 接种不少于100cfu的菌悬液于被检培养基，按规定温度及不短于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。 3 .培养基指示特性检查 加入一定量的标准阳性菌株菌悬液（含菌数不大于100cfu）至被检培养基和对照培养基平板上，按规定温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 微生物检验方法验证 包括计数方法与控制菌检查法验证 计数方法验证：有平板法和薄膜过滤法两种方法，验证要求对照菌回收率不得低于70%。 控制菌检查法验证：要求阳性对照应检出控制菌，阴性对照应无菌生长。 试验中使用的标准菌株有：大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉。 菌种传代不得超过5代,菌液浓度为不大于100cfu/ml 阳性对照试验 为便于研究观察成药制剂中，某些含有防腐剂和抑制菌成分的干扰作用，以及测试常规检验方法和培养基、试剂等的灵敏度时，可将定量的已知阳性对照菌加在供试品稀释液中，按检验供试品的操作方法进行阳性菌的对照试验，阳性对照菌应生长。 抑菌效力检查 定义：在化妆品和药品中为了增加产品的保质期一般都会加入防腐剂，因此需要进行一定的试验来验证防腐剂的防腐效力，通常采用挑战性试验来检测。 调制一定浓度的阳性菌株加入待测产品中，在一段时间内间隔性的取样（第7、14、28天），检测在产品中的残余的菌落数，据此可以判断防腐剂的效力。 能力验证 能力验证是为确保实验室维持较高的核准和检测水平而对其能力进行的考核、监督和确认的一种验证活动。 个人操作技能及某些操作流程的正确性验证。 盲样：按规定操作程序进行检测，但是并不在样品上标明菌的名字而是以代号来代替。 菌种保藏的原则： 降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本上处于休眠 态，生长繁殖受到抑制但不至于死亡，以减低菌种的变异率。 菌种保藏的原理： 菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异。 首先要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）； 其次，还要创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。 美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至一培养基内生长，即认为已传代一次，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。 我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2010年版药典也已做出“菌种的传代次数不得超过5代” 这个明确的规定。 实验室适用的微生物保藏技术 琼脂斜面低温保藏法 液体石蜡覆盖保存法 低温冷冻保藏法 甘油冷冻保藏法 磁珠保存法 冻干保藏法 1.琼脂斜面低温保藏法 适用细菌、霉菌、酵母菌及放线菌保藏 优点：简便、大多数微生物适用 缺点：保藏期短；传代次数多；容易发生菌体自溶及基因突变。 生孢梭菌用硫乙醇酸盐培养基、乙型溶血性链球菌及肺炎球菌用血肉汤（琼脂）培养基 细菌