WB膜的选择供参考学习.docVIP

首先来比较下这几种膜的特点 ? NC 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 较高 低 结合能力 80－110 ug/cm2 400 ug/cm2 125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合） 材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有 操作程序 缓冲液润湿,避免气泡 ?缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿 检测方式 常规染色，可用放射性和非放射性检测 不能用阴离子染料 常规染色， 比较于NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测。 适用范围 0.45um 一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中) 糖蛋白检测和蛋白质测序 价格 价格较便宜 便宜 较贵 1. 硝酸纤维素膜??? 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间， Schleicher Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的Western Blot结果。不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。??? 硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是 Schleicher Schull；Millipore；PALL，另外罗氏、Invitrogen、GE（Amersham）、Santa Cruz等公司都有提供各式的硝纤膜（估计OEM的可能性比较大，不过有时挺奇怪的，OEM的有时比生产厂家卖的还便宜）。 Schleicher Schull的名字拗口——那大概需要舌头在口腔里经过若干次不同弧度和不同速度的上下往返精确运动再配合适当的吐气才能读得准确优雅，不过作为第一个提供硝纤膜的厂家依然广为人知，其NC膜分为纯NC膜和强化NC膜两种：Protran nitrocellulose membrane和Optitran nitrocellulose membrane。前者Protran一直是 Schleicher Schull自豪的产品，这种“100% Pure Nitrocellulose Membranes”。一般而言，NC膜越纯，其蛋白结合能力就越高，所以要增加WB的灵敏度和分辨率，提高所使用膜的纯度是个可以考虑的选择。如果NC膜搀杂一些醋化纤维素——这在前面已经提到，会影响蛋白质结合。而Protran在制作过程中去除了各种杂质，保证了其纯度，从而增加了蛋白结合能力。除了这一点以外，Protran还有低背景、多孔径选择（0.45, 0.2, 0.1um）和保存时间长（实验证明膜上蛋白辨认时间可长达5年！真是“路遥知马力”的典范）等优点。但是Protran由于是纯NC膜，比较脆，机械耐受力欠佳，需要小心操作，如果担心自己“粗手粗脚”，那么就可以考虑一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著称的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。??? Optitran是在一层超薄聚酯支撑膜的两面均匀铺上100%纯的硝酸纤维素，结果表面看起来和纯硝纤膜完全一样，保持了NC膜各种优点，只是内部多了一层中性支持物，大大增强这种强化NC膜的柔韧度和机械耐受力，不容易卷曲，方便操作，特别是重复标记和洗脱的实验。不过有的使用过的人反应不如纯NC膜结合能力强。 NC膜除了一般的Discs、Rolls和Sheets以外，像Invitrogen、Bio-Rad公司还有一种方便顾客使用的“sandwich”三明治形，十分有趣。说它有趣是因为考虑周到，利于高通量操作，但其实也就