第四章 初级分离技术中.ppt

第四章 初级分离技术 一、初级分离 1.何为初级分离？ 初级分离是指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液（细胞破碎液）及其他各种生物原料初步提取目标产物，使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程。 一、初级分离 2.在初级分离中常用的相关技术 ① 沉淀分级 ② 泡沫分离 ③ 膜分离 ④ 萃取 ⑤ 吸附分离 2.1 何谓沉淀分级？ 2.1.1定义——是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。 沉淀与结晶的区别 2.1.2 特点 优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 2.1.3 蛋白质表面特性 1、蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。 疏水性氨基酸残基 形成 亲水性氨基酸残基 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区。 2.蛋白质相对分子质量在5000~1000000之间，分子直径约1~20nm，蛋白质的水溶液呈胶体性质。 3.蛋白质分子间的静电排斥作用，形成了双电层 双电层厚度（ζ电位） 水化层 蛋白质胶体溶液 双电层 2.1.4 常用沉淀方法的分类 1 盐析沉淀（Salt induced precipitation） 1) 盐溶（Salting in）：在低浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度增大的现象。 At low concentration of the salt, solubility of the proteins usually increases slightly. This is termed Salting in. 盐析沉淀（Salt induced precipitation） 2) 盐析（Salting out ）：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。 At high concentrations of salt, the solubility of the proteins drops sharply. This is termed Salting out and the proteins precipitate out. 3) 盐析原理 首先需要了解生物大分子在水溶液中的存在状态： 两性电解质，由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系 蛋白质周围形成水化膜，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞 3) 盐析原理 低盐溶度下，发生盐溶，是因为： 无机盐离子在蛋白质表面上吸附，使颗粒带相同电荷而互相排斥。 无机盐离子增加了蛋白质的亲水性，改善了与水膜的结合，增加了蛋白质分子与水分子的相互作用力，使溶解度增大。 3) 盐析原理——盐析过程 随着中性盐的加入，蛋白质分散体系出现盐析现象 原因如下： A.无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢； B.中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀。 4) 影响盐析的因素 盐的种类和浓度：离子半径小,带电荷多的离子盐析效果好 溶质种类的影响 溶质浓度的影响：样品溶度0.5-2% 蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高； 4) 影响盐析的因素 5)盐析用盐的选择 在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为： 半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子： P04 SO4 CHCOO Cl NO3 ClO4 I SCN 阳离子：NH4 K Na Mg 选用盐析用盐的几点考虑 盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 溶解度受温度影响较小 盐析用盐必须是惰性的 盐溶液密度不高，以便蛋白质沉淀和离心分离 来源丰富、经济 6)常用的盐析用盐 硫酸铵：溶解度大（25℃，767g/L） 硫酸钠 磷酸盐 柠檬酸盐 7)盐析用盐的用量选择 饱和度的概念： 以硫酸铵为例： 25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度。 如果沉淀某一种蛋白质需要60%饱和度的硫酸铵，那么需要硫酸铵固体的量是多少？ 硫酸铵盐析操作 硫酸铵固体加入法： 通常在搅拌下，以少量多次方式缓慢加入，待加入的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。 当蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高时，可