1 基因工程的酶学基础.pptx

基因工程的酶学基础常见的基因工程工具酶及其应用1. 使核酸降解的核酸酶类：2. 催化核酸合成的酶类： 3. 核酸修饰酶类； 核酸内切酶、核酸外切酶DNA连接酶、 DNA聚合酶、逆转录酶、 RNA聚合酶甲基化酶、激酶、基团转移酶、 磷酸酶等第一节 限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。其中专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶(RNase)，而特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶(DNase)。按水解断裂核酸分子的方式不同，可分为两种类型：一类是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫核酸外切酶(exonuclease)；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫核酸内切酶(endonuclease)。第一节 限制性核酸内切酶一、基本概念及其生物功能限制性核酸内切酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》统计，仅II型限制性核酸内切酶就已从各种不同的微生物中分离出了2300种以上，可识别230种不同的DNA序列。1. 来源主要是从原核生物中分离纯化出来。内切酶。2. 性质即在核酸分子链的内部制造切口的酶。3. 功能帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制和修饰系统（R/M体系）限制/修饰系统 (R-M, Restriction-modification system)B和K分别代表大肠杆菌的B和K菌株（引自Streips等, 2002） 寄主控制的限制与修饰的机理 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体受到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。 寄主控制的限制与修饰机理　修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。 甲基化酶：甲基转移酶① Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基② Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG 第二个C上C5位置上引入甲基限制/修饰系统几乎所有的限制性内切核酸酶都和能识别、甲基化相同DNA位点的甲基转移酶（MTase）共同作用，一起构成限制-修饰系统。 各种细菌都能合成一种或几种能够切割双链DNA的内切核酸酶，以此来限制外源DNA的入侵寄主控制的限制与修饰的作用: 　一是保护自身的DNA不受限制；　二是破坏外源DNA使之迅速降解。 基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。二、限制性内切酶的类型目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。I 型限制性内切酶II 型限制性内切酶 III型限制性内切酶 1. I型限制性内切酶首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。如 EcoB和 EcoK。（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。Recognize sitecut1-1.5kb（3）作用机理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。2. III型限制性内切酶 在完全确定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM (S-腺苷蛋氨酸)的激活作用。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG在基因工程操作中用途不大。3. II型限制性内切酶 1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先从流感嗜血杆菌d株中分离出来。 分离的第一个酶是Hind II，其次是 Hind III （1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。 与DNA的来源无关。切割位点C-C-G-C-G-GG-G-C-G-C-C切割位点对称轴识别序列4-8个核苷酸序列大部分呈旋转对称、反向重复结构-----回文结构（2）切割位点切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：识别位点处EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端EcoR V 5’-GAT?ATC-3’ 3’-CTA?TAG-5’ 产生平齐末端（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：① 5’端凸出（如