3.生物技术制药-基因工程.ppt

PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。 变性、退火、延伸三步曲 变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 复制延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得——230（1.07×109)个基因片段 PCR 琼脂糖凝胶电泳 最终产物 紫外光观察 3-4 小时 PCR的应用领域: 生物学领域几乎无处不用 基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） /基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE） 耐高温DNA聚合酶的种类 Taq DNA聚合酶 (Thermus aquaticus，Cetus/Roche) Tth DNA聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo) Pfu DNA聚合酶 （Pyrococcus furiosus，Stratagene） Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Tfl DNA聚合酶 （Thermus flavus，Promega) Tli DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚合酶 ( Pyrococcus woesei，Roche) Pfx DNA聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen) Dynazyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme） FD DNA聚合酶 (Thermus sterophilus？，复旦大学) Tma, Tne, KOD, …… 9. DNA测序 确定一条染色体片断上的碱基顺序。 Sanger法： 在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA, ddT, ddC, ddG（相应于4种碱基） ddX的两个作用： 可以当作正常碱基参与复制 一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接 电泳 谁终止，碱基就是谁 此方法获1974年的Nobel奖 Sanger第一步：加入复制终止剂 荧光检测探头 电泳，看谁跑得快 Sanger第二步：荧光检测 全自动的测序仪器：MegaBace 已完成测序工作的生物 面包酵母 线虫 果蝇 拟南芥 2002年中国科学家公布水稻基因组 A Draft Sequence Assembly of the Rice Genome Science 2002 April 5; 296(5565): p. 79-92 Refer Science Online： /cgi/content/abstract/296/5565/79 2000年6月白宫的庆典人类基因组测序完成 Venter Collins * /chemistry/laureates/1993/mullis-lecture.html /chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65. * PCR传奇－－一个生物技术的故事。 保罗·拉比诺著，朱玉贤译。上海科技教育出版社， 1998。 　基因工程制药 第一节　基础知识 第二节　基因工程制药的基本方法 第一节　基础知识 1. 细胞的结构（真核和原核） 真核细胞 原核细胞 细胞大小 非细胞生命体 2. 细胞核中的染色体 染色体chromosome DNA 长度: 4.6 x 107 bp = 1.5 cm Chromosome 长度: 2 μm 压缩率 = 8000 1 30 nm 纤维 30 nm 染色质纤维 5 压缩率 = 50 H1 H1 H1 H1 H1 H1 消化时间 Mononucleosome Chrom