竞争ELISA法测莱克多巴胺的残留解决方案.pptVIP

竞争ELISA法测 莱克多巴胺的残留 背景： 莱克多巴胺能促进蛋白质的合成，提高猪的瘦肉率，且号称“代谢更快、残留更少”，成为“新型瘦肉精”。 人体摄入过多含有 RAC 残留的食品会有很大危害. 酶联免疫吸附实验（ELISA），它是使抗原或抗体吸附于固相载体，使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行，提高了灵敏度，即可检测抗原，也可检测抗体。实验方法包括间接法、夹心法及竞争法等。 * * 竞争法 * * 实验目的 1、掌握竞争ELISA的原理和操作方法； 2、掌握标准曲线的绘制和使用方法； 3、了解影响ELISA反应的条件。 实验材料 抗原: 莱克多巴胺 检测物： 含Rac的样品 竞争物:不同浓度的Rac的竞争物(100ng/ml 50 ng/ml等 ) 一抗： 抗Rac的特异性单抗 酶标二抗： HRP标记羊抗鼠二抗 包被液：0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液 封闭液：5% 脱脂奶粉 洗涤液： 0.01M pH7.4 PBS + 0.5% Twen-20（PBST） 底物液：A液：Tris.cl+H2O2 B液：TMB（四甲基联苯胺） 终止液：2M H2SO4 96孔聚苯乙烯反应板、移液器、恒温箱（37℃）。 实验步骤 1、取4条已经包被好的板孔放入板架中， 2、向前3条A,B,C,D,E,F,G,H中分别加不同浓度Rac竞争物 50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.125ng/ml ，1.5625ng/ml ，0.78125，0(PBST)，8个浓度 ,每孔50ul 。 3、第4条中A,B,C孔加样品1。 E,F, G孔中加样品2 ， 每孔样品50μl。 4、向所有板孔中加入稀释好的一抗 50μl 。 5、放入37度温箱中孵育45min 。 6、甩掉板中的液体后，用PBS-T洗液洗3遍，每次3分钟。 7、向每个板孔中分别加入稀释好的二抗（1：8000）100μl，放入37度温箱孵育30min 。 8、甩掉板中液体，用PBS-T洗液洗5遍，每次3分钟。 9、向每个板孔中分别加底物液A、B各50μl，避光反应10分钟。 10、取出后向板孔中各加入 50μl 终至液（2M/L的H2SO4） 11、用酶标仪读出数据，作出标准曲线，求出样品中的含量。 * * 获得标准曲线 样品1 样品2 50 A 25 B 12.5 C 6.25 D 3.125 E 1.5625 F 0.78125 G 0 H 1 2 3 4 竞争物浓度(ng/ml ) 50ul竞争物+50ul一抗 50ul样品1+50ul一抗 实验步骤：依次加入50ul竞争物 --- 加入50ul一抗/孔 ---- 孵育1h --- 洗涤---- 加二抗100ul/孔--- 孵育45min ----洗涤---- 加入A、B液显色----检测OD值。 50ul样品2+50ul一抗 50ul竞争物+50ul一抗 求样品含量的方法: 通过竞争ELISA先得到一条线性关系比较好的标准曲线，得出关系方程。然后通过测得的样品OD值，算出B/B0%,带入其方程从而求出样品中该物质的含量。 log2 竞争物浓度ng/ml OD值 550 0.145 425 0.1495 312.5 0.247 26.25 0.361 13.125 0.603 01.5625 0.8515 -00.78125 1.156 0 1.187 样品的浓度的计算：通过所得的标准曲线将测得相应的OD450值，换算成莱克多巴胺含量 以Rac浓度的对数值为横坐标，以B/B0%为纵坐标（B:不同竞争物浓度在的OD450,BO:竞争物浓度为0时的OD450），再添加误差线。 * *