第5章 基因工程（一）幻灯片.pptVIP

基因工程的突出优点 1、跨越天然物种屏障，打破物种界限； 2、定向根据人们的意愿、目的改造生物的遗传特性，甚至创造新的生命类型； 3、加快了改变生物遗传性状的速度。 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 二、 DNA连接酶（DNA ligase) （1）大肠杆菌连接酶 1、 DNA连接酶的类型 只能连接粘性末端。 （2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接平齐末端。 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA 3’端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ 2、连接条件 （3）需要能量 （4）适宜温度 最适温度37 ℃，但此时粘性末端连接很不稳定。一般14~16℃. 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 3、 DNA连接酶的用途 （1） 两个双链DNA片段连接 5ˊ- ACG AATTCGT-3ˊ T4DNA连接酶 5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ 3ˊ- TGCTTAA GCA-5ˊ 3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ （2） 修补缺口双链DNA分子 T4DNA连接酶 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 三、 DNA聚合酶（DNA polymerase) 大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow fragment T4 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶 末端转移酶 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 （一） DNA聚合酶的异同点 共同点——把dNTP连续加到引物3’—OH端。 区别——持续合成能力和外切酶活性。 高 快 有 无 Taq DNA聚合酶 高 快 有 高 快 有 中 低 无 无 逆转录酶 中 低 无 无 逆转录酶 中 低 无 无 逆转录酶 高 快 无 高 T7DNA聚合酶 高 快 无 高 T7DNA聚合酶 高 快 无 高 T7DNA聚合酶 低 中 无 高 T4DNA聚合酶 低 中 无 高 T4DNA聚合酶 低 中 无 高 T4DNA聚合酶 低 中 无 低 Klenow fragment 低 中 无 低 Klenow fragment 低 中 无 低 Klenow fragment 低 中 有 低 大肠杆菌DNA聚合酶I DNA聚合酶类型 3’-5’酶切活性 5’ -3’酶切活性 聚合速度 持续能力 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 （二） 大肠杆菌DNA聚合酶I 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 是Kornberg 1956年首先从大肠杆菌E.Coli 细胞中分离出来的。是一种多功能性的酶。 5′- 3′聚合酶活性 以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。 5′- 3′外切酶活性 将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。 3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。 CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 2、大肠杆菌DNA聚合酶I 的反应条件 ① 底物： ② Mg2+ ③ 带有3’—OH游离端的引物 ④ DNA模板 -OH 5’ 3’ dNTP dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 A. 制备DNA探针 利用其5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于DNA连接后的大缺口填充 利用5′--3′的聚合酶活性。 C. 用于DNA的序列分析 利用5′--3′的聚合酶活性。 3、大肠杆菌DNA聚合酶I 的用途 第二节 重要工具酶 商丘师范学院·生命科学系 大肠杆菌聚合酶I的应用示例 CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ 缺口转移 (Nick translation) CCG GGCTATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ A T A G CCT 第二节 重要