第二章 基因工程与食品产业总结幻灯片.pptVIP

基因工程（gene engineering)： 　 所谓基因工程，就是利用DNA体外重组或扩增技术从供体生物基因组中分离感兴趣的基因或DNA片段，或是经过人工合成的方法获得基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应产生重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。 工具酶和基因载体 1、基因工程的工具酶 限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酯酶 S1核酸酶 逆转录酶 　 限制性内切酶（RE表示） 分类： 利用基因工程改造食品微生物 1、改良微生物菌种——基因工程菌 例：面包酵母菌——促进发酵 啤酒酵母菌 2、微生物酶分子的人工进化 * I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS位于染色体上，三 个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM （５—腺苷甲硫氨酸）。 II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两 种基因位于质粒上。 III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成 一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 限制性内切酶的定义、命名 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指 II型限制酶。 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编 号、分离顺序。 例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名 称H. influenzae，“ｄ” 表示菌系为ｄ型 血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三种限制酶。 限制酶的特点 识别顺序和酶切位点； 识别４-8个相连的核苷酸； 富含ＧＣ； 对称性；（回文结构） 切点大多数在识别顺序之内，也有例外； 限制酶切后产生两个末端，５’-Ｐ和３’-ＯＨ。 末端种类： ３’-端突起，个数为２或４个核苷酸； ５’-端突起，个数为２或４个核苷酸； 平齐末端。 限制酶切末端特点 5’-突起末端： EcoRI 5’—GAATTC—3’ 5’—GOH PAATTC—3’ 3’—CTTAAG—5’ 3’—CTTAAP HOG—5’ 3’-突起末端： Pst I 5’—CTGCAG—3’ 5’—CTGCA G—3’ 3’—GACGTC—5’ 3’—G ACGTC—5’ 平端： SmaI 5’—CCCGGG—3’ 5’—CCC GGG---3’ 3’—GGGCCC—5’ 3’—GGG CCC—5’ 限制酶的用途 DNA重组； 限制酶（物理）图谱绘制； 突变分析（RFLP分析）； 限制酶的部分酶切与完全酶切。 DNA 连接酶 T4 DNA连接酶 特点：只连接ds -DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基 用途：用于不同DNA分子的连接，形成重组DNA分子 1) 相同或相容粘性末端的连接 2) 平整末端的相连 DNA聚合酶 E.coli 的DNA聚合酶系统 催化5’→3’方向合成DNA Pol I 参与DNA修复 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 pol II 同上 具3’→5’外切酶活性 pol III 参与DNA复制 具3’→5’和5’→3’外切酶活性 E.coli polI的特点： 1） 具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋 白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段, polIK) 2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响 3） 外切酶活性 E.coli polI用途： 1） 除去3’-端突起的单链DNA 2） 补齐5’-突起端 3） 合成第二条cDNA链 4） 切