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高pH で使用可能なコアシェル型カラム、 Agilent Poroshell HPH-C18 による分析 技術概要 はじめに 化学および製薬分野の分析のための高速液体クロマトグラフィー (HPLC) メソッド開発 は、困難な作業です。十分な分離能と堅牢な分離を得られるように、幅広いクロマトグ ラフィー条件をスクリーニングする必要があります。メソッド開発には、要素を 1 つず つ処理していく方法やクオリティ?バイ?デザイン (QbD) など、多くのアプローチがあ りますが、分離最適化に用いられる目標や要素はどれも同じです。複数の要素が、クロ マトグラフィー分離能 (RS)、効率 (N - 粒子の粒度、粒子形態、カラムの長さによりコン トロール)、リテンション係数 (k - 溶媒強度によりコントロール)、選択性 (a - 結合相の 選択および移動相によりコントロール) に影響を与えます (図 1)。なかでも、選択性 (a) はもっとも影響の大きい要素です。 N 上昇 a 上昇 k 上昇 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 段数 : 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 アルファ : 1.10 1.35 1.60 1.85 2.1 k’: 2.0 4.5 7.0 9.5 12.0 S = N R (a ? 1) k 4 (k + 1) a 図 1. 典型的なメソッド開発パラメータ。分離能における選択性、 効率、リテンションの影響  メソッド開発には、単純な混合物や複雑な混合物の分離が伴い ます。選択性はいくつかの要素によりコントロールすることがで きます。たとえば、固定相の選択、有機溶媒の種類、グラジエ ントの勾配、流量、温度などの要素があります。イオン性化合 物の場合、緩衝液の pH も影響の大きいパラメータとなります。 イオン性化合物の分離を最適化し、堅牢な条件を特定すること は、液体クロマトグラフィーのメソッド開発における重要な手順 です [1]。ほとんどの医薬品および生物学的化合物には、カルボ ン基やアミノ基などのイオン性官能基が含まれます。逆相液体 クロマトグラフィー (RPLC) 分離では、きわめて強力な選択性 ツールとして pH が利用されています。低 pH 分離にはプロトン 化された酸および塩基が含まれますが、そうした酸や塩基は高 pH で脱プロトン化されます。逆相クロマトグラフィーのリテン ションは成分の電荷に大きく影響されるため、pH を利用すれば、 選択性を大きく変化させることができます。酸性 pH では、酸は 中性になるためリテンションが最大になりますが、塩基は完全に 荷電されるため、リテンションは最小になります。塩基性 pH (化 合物の pKa より高い pH) では、塩基は中性になるためリテン ションが最大になりますが、酸は完全にイオン化されるため、リ テンションは最小になります。RPLC において、塩基性成分で最 高のピーク形状、リテンション、サンプルローディングを得るた めには、移動相の pH を分析対象化合物の pKa よりも 2 単位高く する必要があります。中性化合物のリテンションは、pH の影響 を受けません。この研究では、Agilent Poroshell HPH-C18 カラム を用いて、pH の調節により選択性をコントロールしました。 Agilent Poroshell HPH-C18 カラムは、高 pH 移動相で安定性が得 られるように設計されています。 材料とメソッド この研究には、Agilent 1260 Infinity LC を使用しました。 ? Agilent 1260 Infinity バイナリポンプ G1312B ? Agilent 自動液体サンプラ (ALS) G1367C ? Agilent 1260 Infinity カラムコンパートメント (TCC) SL G1316C ? Agilent 1290 Infinity ダイオードアレイ検出器 (DAD) G4220A (10-mm パス、1 μL ボリューム) ? HPLC のコントロールとデータ処理には Agilent OpenLab バージョン C.01.05 を使用 ? Agilent Poroshell HPH-C18、2.1 × 50 mm、2.7 μm (p/n 699775-702) または Poroshell HPH-C18、 4.6 × 50 mm、2.7 μm (p/n 699975-702) 一部の実験では、Agilent