地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析.docVIP

地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析 　　[摘要] 酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶，在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用。根据地黄转录组数据，克隆了地黄酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC的全长cDNA序列（GenBank登录号KU640395），并进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRTPCR）检测其在地黄不同组织及4种诱导子处理后毛状根中的表达量。结果表明，RgTyDC ORF为1 619 bp，编码509个氨基酸，相对分子质量为56.6 kDa，等电点pI 6.25。RgTyDC与芝麻酪氨酸脱羧酶SiTyDC和猴面花酪氨酸脱羧酶EgTyDC的同源性最高，均为88%。RgTyDC基因在叶片（尤其是衰老的叶片）中表达量较强，在块根中表达量较低。SA和MeJA处理后显著上调表达。这为进一步研究RgTyDC在地黄苯乙醇苷类成分生物合成中的分子功能奠定基础。 　　[关键词] 地黄； 酪氨酸脱氢酶； 克隆； 诱导子； 表达 　　地黄Rehmannia glutinosa L.为玄参科多年生草本植物，以块根入药，是我国著名的“四大怀药”之一，为常用大宗药材，具有重要的药用价值和经济价值。其道地产区在河南古怀庆府（现焦作的温县、武陟、沁阳、博爱等地），山东、山西、黑龙江、甘肃等地也都有较大的种植面积。目前在河南省焦作市（道地产区）种植面积已逾1.5万hm2，产值在数十亿元[1]。研究表明，地黄含有丰富的苯乙醇苷类成分[23]。苯乙醇苷类（phenylethanoid glycosides，PhGs）成分是一类由苯乙醇苷元与糖基结合而成的苷类化合物，又由于多数化合物糖上连有咖啡酰基或阿魏酰基，又称其为苯丙素类化合物（phenylpropanoid glycosides，PPGs）[4]。玄参科、列当科、马鞭草科、唇形科、木犀科、车前科等多种双子叶植物中均有分布，具有抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节、保肝、抗肿瘤等多种药理性[5]。 　　目前关于植物苯乙醇苷类成分生物合成的分子机制研究报道较少。推测这类成分的母核来源于桂皮酸途径生成的酪氨酸，酪氨酸在酪氨酸脱羧酶（tyrosine decarboxylase，TyDC）作用下生成酪胺，并在酪胺羟化酶（tyramine hydroxylase，TyH）作用下生成多巴胺，或是酪氨酸在酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）作用下生成多巴，在多巴脱羧酶（DOPA decarboxylase，DODC）作用下生成多巴胺，多巴胺再经一系列酶催化生成苯乙醇苷类成分（图1）。TyDC是合成苯乙醇苷类的关键限速酶，在苯乙醇苷母核的形成中发挥重要的作用。目前仅在模式植物拟南芥Arabidopsis thaliana[6]、水稻Oryza sativa[7]和药用植物罂粟Papaver somniferum[8]、红景天Rhodiola rosea[9]、马兜铃Aristolochia contorta[10]等克隆了TyDC基因。 　　本文根据已经报道的TyDC基因的信息，在课题组前期测定的转录组数据库中通过同源比对获得了4条EST序列，通过设计特异引物，应用RTPCR的方法克隆出地黄TyDC基因，进行序列比对和系统进化分析，组织表达和诱导子处理表达特性分析，为阐明地黄毛蕊花糖苷为代表的苯乙醇苷类成分的分子调控机制提供参考。 　　1 材料和方法 　　1.1 样品 以地黄“温855”为实验材料，经由河南农业大学中药材系高致明教授鉴定为R. glutinosa。种植于河南农业大学百草园中药材教学园区，在地黄出苗后90 d取块根、须根、茎、老叶、初展开叶和嫩叶的鲜样，在液氮中保存。以实验室培养的发根农杆菌A4诱导的“温855”毛状根体系为诱导子处理的材料。 　　1.2 RNA的提取与反转录 每个样品取材约50 mg，以MiniBEST试剂盒（TaKaRa，大连）进行柱式法提取地黄总RNA，提取方法参考说明书进行。反转录采用反转录试剂盒（TaKaRa，大连），用于cDNA第一链合成需要2 g 的总RNA，1 μL oligo dT （50 μmol?L-1）引物，1 μL dNTP，0.5 μL RNase抑制剂（40 U?μL-1），1 μL PrimeScript Ⅱ反转录酶（200 U?μL-1），终体积为20 μL。反应条件为：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，之后95 ℃ 5 min。 　　1.3 基因克隆 以拟南芥Arabidopsis thaliana AtTyDC的cDNA（NM_179668.1）为查询序列，在本课题组前期测定的转录组EST数据库中进行同源搜索，应用序列分析工具DNAMAN和DNASTAR对获得的EST序列进行