第九章 免疫标记技术（参考）.pptxVIP

第四章 免疫标记技术免疫标记技术（immunolabelling technique） 用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。免疫标记技术分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位第八章 免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术第八章 免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术第一节 放射免疫技术 一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型放射免疫技术（radioimmunoassay，RIA）（1977年获诺贝尔生理和医学奖）免疫放射技术（immunoradiometric assay，IRMA） 1986年Miles和Hales建立免疫放射分析技术（immunoradiometric assay，IRMA） 标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，待测物（或标准品）和同位素标记抗体全量反应。优点： 灵敏度高（可提高6-10倍）、准确度高、重复性好、检样量少缺点： 干扰因素较多、检测仪器贵、有放射性污染第一节 放射免疫技术 一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术的原理 RIA是以放射性同位素标记抗原的一种竞争性免疫抑制试验第一节 放射免疫技术 一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型二、放射免疫技术的基本条件 1．抗原标准品与待测抗原 2．特异性抗体3．放射性同位素4．常用的同位素标记方法5．B与F的分离技术1．抗原标准品与待测抗原 标准品是放免技术的定量依据 标准品：与待测样品的化学结构完全相同 替代品：与待测样品的结构相似，但要与抗体的亲和力相近，应列出与真标准品的换算系数。2. 特异性抗体 放射免疫技术的抗体应具备：特异性高、亲和力高（平衡常数K值大）、效价高（即抗血清高度稀释时仍能迅速与抗原结合，极少解离，保证检测的灵敏度） 3. 放射性同位素4. 常用的同位素标记方法 氯胺T氧化标记法 乳过氧化物酶标记法5. B与F的分离技术 结合态标记抗原B与游离态标记抗原F能否有效地分离是放射免疫技术的一个重要环节。（1）双抗体沉淀分离法（2）化学试剂分段沉淀分离法（3）固相法（4）吸附法分离剂的要求 能使B和F完全分离 不受外界因素的干扰 与游离抗原的非特异性作用尽可能小 操作简便、分离迅速、重复性好 来源广，经济，便于使用（1）双抗体沉淀分离法 加入第二抗体使微量抗原抗体复合物的分子加大，从而使原来不能用普通离心法沉淀的抗原抗体复合物易于沉淀而分离。 本法为目前应用最广泛的分析方法优点： 本法操作简便、稳定缺点： 易受免疫反应液中其他蛋白质或盐的干扰，使非特异性吸附有较大变异，且第二抗体消耗量大。 （2）化学试剂分段沉淀分离法优点： 试剂来源广泛、 价格便宜缺点： 影响因素多（温度、pH值、浓度等） 利用盐类或有机化合物使反应液中的?-球蛋白在等电点沉淀，从而达到分离的目的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸铵等（3）固相法 将测定用的第一抗体（或第二抗体）牢固地结合于固相载体表面，相应抗原（或第一抗体）经温育被吸附，只要将固相表面洗涤即将B和F分离。 优点：操作简便、快速 新的固相分离方法： 纤维固相抗体竞争法 可磁化颗粒固相抗体竞争法 试管固相法（4）吸附法 本法多用于小分子半抗原的放射免疫分析。 如：活性炭、硅镁吸附剂、滑石粉等性质：对蛋白质、多肽、药物等具有非特异性 吸附的能力应用：在其表面包被一层白蛋白或右旋糖苷等 物质时，将会限制大分子物质的吸附。 沉 淀 中：吸附有游离的抗原或半抗原 上清液中：抗原抗体复合物优点：操作简便、分离迅速缺点：专一性不强 第一节 放射免疫技术 一、放射免疫技术的原理 二、放射免疫技术的基本条件 三、放射免疫技术的基本类型三、放射免疫技术的基本类型1. RIA法2. 经典IRMA法3. 双抗体夹心法4. 二抗标记法5. 双标记抗体法1. RIA法2. 经典IRMA法3. 双抗体夹心法标记4. 二抗标记法5. 双标记抗体法 双标记抗体是将两种针对不同表位的抗体（Ab2、Ab3）标记上不同的同位素，可以用不同的检测仪进行测定。第八章 免疫标记技术第一节 放射免疫技术第二节 免疫荧光技术第三节 酶免疫技术第四节 其他免疫标记技术第二节 免疫荧光技术 一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、免