4第四章5酶讲解.ppt

影响最适温度（T0）的因素， T0的特点 1、是一个有条件的特征常数，受底物种类、作用时间等影响。[S]越大T0常越大，因为底物对酶有保护作用。 2、水分活度的影响：酶在干燥状态较之潮湿状态下对温度的耐受力越强。 3、高温可以使酶失活，低温抑制酶的活性。 一般温度60℃可抑制酶的活性， 80℃可使酶失去活性。 耐高温的酶：α-淀粉酶（93℃）啤酒中的麦芽糖 嗜冷酶：-5℃，南极生物体 酶的再生现象 失活后24h或更长时间内酶的活性可恢复。 例如：乳过氧化物酶，125 ℃高温瞬时杀死。24小时后可检测到。 豌豆过氧化物酶：速冻产品先漂烫，杀死酶后速冻。 2月后可检测到。 磷酸酯酶：特鲜酱油，80 ℃杀菌，3个月后出现；罐头，121 ℃杀菌，6月后出现。 第六节 酶的分离纯化与酶活力测定 一、酶的分离纯化 1、基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作，加入的化学试剂不使酶变性，操作中加入缓冲溶液。 2、基本操作程序： 选材：微生物（微生物发酵物: 胞内酶，胞外酶），动物（动物器脏：消化酶，血液：SOD酶，尿液：尿激酶等）,植物（木瓜、菠萝、生姜、无花果蛋白酶等）。 抽提：加入提取液提取。具有一定离子强度的缓冲液。 胞内酶先要进行细胞破碎（机械研磨，超声波破碎，反复冻融或自溶等） 分离：先进行净化处理（过滤，絮凝，离心脱色），再采用沉淀法分离（盐析法，有机溶剂沉淀法，超离心等）。注意：有机溶剂不可反复使用。 纯化：可采用离子交换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等方法。 3、酶的制剂形式： 固体：干燥（冰冻升华，喷雾干燥，真空干燥） 液体 4、保存：低温下短期保存。 二、酶活力的测定 1、概念 酶活力：又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。 基本原理:酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，一般对酶的测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即V=K［E］），故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。 2、酶活力测定 酶活力测定就是测定一定量的酶，在单 位时间内产物(P)的生成（增加）量或 底物（S）的消耗（减少）量。即测定 时确定三种量： ①加入一定量的酶； ②一定时间间隔； ③物质的增减量。  测定酶活力常有以下几种方法： ①在一个反应体系中，加入一定量的酶液，开始计时反应， 经一定时间反应后，终止反应，测定在这一时间间隔内发生 的化学反应量（终止时与起始时的浓度差），这时测得的是 初速度。 ②在一定条件下，加入一定量底物（规定），再加入合适量 的酶液，测定完成该反应（底物反应完）所需的时间，（非 初速度，为一平均速度）。 ③动态连续测定法。在反应体系中，加入酶，用仪器连续监 测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成。 ④快速反应追踪法。近年来，追踪极短时间（10-3s以下）内 反应过程的方法和装置已经应用。其代表有停流法 （topped-flow）和温度跃变法（temperature jump）。 3、酶反应条件优化： 测酶活所用的反应条件应该是最适条件，所谓最适条件包括最适温度、最适pH、足够大的底物浓度、适宜的离子强度、适当稀释的酶液及严格的反应时间，抑制剂不可有，辅助因子不可缺。 4、酶活力测定方法： 反应计时。反应计时必须准确。反应体系必须预热至 规定温度后，加入酶液并立即计时。反应到时，要立 即灭酶活性，终止反应，并记录终了时间。终止酶反 应，常使酶立刻变性，最常用的方法是加入三氯乙酸 或过氯酸使酶蛋白沉淀，也可用SDS使酶变性，或迅 速加热使酶变性。有些酶可用非变性法来停止反应或 用破坏其辅因子来停止反应 。 反应量的测定。测底物减少量或产物生成量均可。在 反应过程中产物是从无到有，变化量明显，极利于测 定，所以大都测定产物的生成量。 具体物质量的测定，据被测定物质的物理 化学性质通过定量分析法测定。常用的方 法有： 光谱分析法：酶将产物转变为（直接或间接）一个可用分光光度法或荧光光度法测出的化合物。 化学法：利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物，然后再反过来算出酶的活性。 放射性化学法：用同位素标记的底物，经酶作用后生成含放射性的产物，在一定时间内，生成的放射性产物量与酶活性成正比。 三、酶活力的表示方法及计算 酶活力单位 酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物 的增加量表示，单位为mol/min等。 酶活力单位的基本定义为：规定条件（最适条件）下一 定时间内催化完成一定化学