PCR技术培训讲义.pptVIP

主 要 内 容 定量PCR技术的原理 定量PCR技术的应用 病原体鉴定 SNP分型 基因表达 转基因检测 DNA的生理功能 DNA半保留复制特点和条件 特点：半保留，精确 子代分子含有一条母链和一条新合成的新链；子代分子与亲代分子结构完全相同。 条件：DNA聚合酶，引物，原料（dNTPs），温度，缓冲液 PCR技术（polymerase chain reaction, PCR） 1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室科学家Mullis发明，使体外基因扩增真正得以实现。1986-1988年随着耐热DNA聚合酶的分离纯化和使用，PCR技术逐渐在分子生物学领域得到广泛应用。从1989年起，PCR技术开始进入临床应用，并迅速成为临床分子遗传学检验最重要的技术平台。 PCR技术 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR） 模仿天然DNA复制技术，在一对人工合成寡核苷酸和高温聚合酶作用下，在合适条件下，特异地扩增出DNA片段。一个循环后，DNA模板增加一倍，PCR就是在这些合适条件下的循环不断重复，从而使DNA产量呈指数增加。 常规PCR过程由三步组成： 变性：DNA模板被加热至94°C，此时双链DNA被分解成两条单 链DNA。 复性：两条特定的寡核苷酸引物分别和两条单链DNA的端口复性（温度范围37 °C ~65 °C ） 延伸：复性后的DNA片段，在聚合酶的作用下（72 °C ）延伸。 荧光定量PCR原理 TaqMan技术 寡核苷酸探针的5‘端标记了一条荧光报告基团（R），3’端标记了一条荧光淬灭基团（Q）。当这条探针处于完整状态或者没有反应时，荧光报告基团（R）所产生的一部分荧光将被荧光淬灭基团（Q）吸收或淬灭，即荧光报告基团（R）所产生的一部分荧光能量转移到荧光淬灭基团（Q）上。 在PCR反应中，该探针可与PCR目标基因发生杂交，并由Taq酶的外切功能，荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）都可被切断，使得淬灭功能消失。游离的荧光报告基团（R）可被检测。 随着PCR反应的进行，被切断的荧光报告基团（R）与PCR产物相对应的增加。因此，根据荧光报告基团（R）产生的荧光信号的强弱，即可测量出PCR反应产物的数量。 TaqMan探针法定量的特点 High specificity--- primer and probe based high accuracy Multiple Reporter---Mutation Detection SYBR? Green 1 染料法定量的特点 Primer-based specificity Target identification (screening) assays Convenient than Taqman Low-cost assays where high specificity is not required Can not do mutation Detection 荧光定量PCR仪的应用 定量检测 绝对定量 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 点突变检测 与疾病相关的等位基因点突变检测 SNP检测 荧光定量PCR仪的应用 相对定量研究 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究 荧光定量PCR仪的应用 突变检测 终点结果 Structure of TaqMan? MGB Probes 预防污染的方法 Uracil-N-Glycosylase (UNG) Acts on single/double-stranded dU-containing DNA ROX校正 减少孔间差异，提高数据精确度 诊断反应异常 TaqMan的ROX校准 U U U U 50°C, 2 min. Add UNG UNG酶 金牌Taq酶 经过修饰，常温下没有活性 95 ℃10min热启动后才能做PCR 阻断加样时的随机扩增，降低本底 活力特别高 热启动 管家荧光 Rn = RReporter / RROX Reporter / Reference Reporter Reference With ROX Without ROX Beta actin TaqMan * * TaqMan 探针法 SYBR Green I 染料法 荧光定量PCR技术的原理及特点 荧光定量PCR技术采用了和传统PCR技术完全相同的生物化学体系，对DNA进行扩增放大。只是为了适时检测和分析DNA含量的变化，