PCR(生物化学)培训讲义.pptVIP

PCR工作原理 以要扩增的DNA分子为模板， 以一对与模板5`末端和3`末端互补的寡核甘酸片段为引物 4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下 依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR特异性取决于引物和模板DNA结合特异性。 体外(试管中)扩增特异DNA片段短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上 PCR技术 特点 敏感度高、特异性强、产率高、 重复性好、操作简便、快速 PCR体系基本组成 模板DNA： （102-5）拷贝 dNTP底物：20—200umol/L 特异性引物： 0.1—0.5 umol/L DNA聚合酶：Klenow T4 、 T7聚合酶 TaqDNA聚合酶:耐热稳定性、5`-3`聚合酶活性及3`-5`外切酶活性，可校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。 含Mg2+的缓冲液： Mg2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.5—2.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。 反应分三步： 1 变性 denaturation： 加热90-95℃，模板DNA双链解离形成单链DNA； 2 退火 annealling： 温度突然降低,引物与模板DNA结合, 40-60℃,Tm值{4（G+C）+2（A+T）}-5℃. 3 延伸 extension： TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+ 存在 的条件下，催化DNA合成。 70-75℃时间---要扩增片段长度决定 PCR产物的检测 琼脂糖凝胶电泳；（EB） 分子杂交； 限制性内切酶酶切分析； 微孔板夹心杂交法； 直接测序 PCR新技术 RT-PCR：用于RNA分析 PCR-SSCP：可用于点突变分析 热启动PCR：可提高特异性。 不对称PCR（asymmetric PCR） 多重PCR(multiplex PCR) 巢式PCR(nested PCR) 实时定量 PCR (Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR) 实时荧光定量PCR技术 实现了PCR从定性到定量的飞跃 实时荧光定量PCR原理 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 特异性更强、 有效解决PCR污染、 自动化程度高、 实时监测反应过程 Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中重要概念 —— Ct值 C代表Cycle，t代表threshold，Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数 Ct值与起始模板的关系 每个模板Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数标准品作标准曲线，横坐标起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。 荧光定量PCR所使用的荧光化学 荧光染料 SYBR Green I 荧光探针 TaqMan荧光探针 Moleculae Beacons Scorpions TM探针 Lightcycler SYBR荧光染料 在PCR反应体系中，SYBR Green I荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 对引物质量要求较高 TaqMan荧光探针 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 * 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) 根据细胞分裂中 DNA 半保留复制机理，在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。 循环次数取决于模板DNA的浓度30次—扩增100万倍 1. 长度： 15 - 30 个核苷酸； 2. 避免嘌呤、嘧啶堆积， G＋C ％ ：40 - 60％； 引物设计的原则 Tm = 69.3 + 0.41 (G + C%) 引物长度为 18 - 24 个碱基： Tm (?C) ＝ 4 (G＋C) ＋ 2 (A＋T) 5’ ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG 3’ G＋C ＝ 12；A＋T ＝ 8 Tm ＝ 4 X 12 ＋ 2 X 8 ＝ 64?C 3. 四种碱基随机分布； 4. 引