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上机实习 从NCBI上下载Mycobacterium Tuberculosis Ag85a基因序列 以该序列为模板设计一对用于扩增200～500bp序列的引物 以Excel订单形式提交引物 引 物 设 计 引物 引物的重要性 引物设计的原则 引物与PCR 引物设计软件 如何使用Primer Premier 5.0 引物设计实例 引物（primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 → ← 3’ 3’ 5’ 5’ Sense primer Antisense primer 引物的重要性 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。 引物设计原则 引物长度 碱基分布的均衡性 Tm值（ 熔解温度） 引物3’端 引物5’端 引物二级结构 引物二聚体 引物的保守性与特异性 扩增区域的二级结构 特异、高效 引物长度 一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 引物Tm值（熔解温度） 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于30个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15　　 引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸。 引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。 引物二级结构 发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 3’ 5’ 5’ 3’ 引物二聚体 引物二聚体(Dimer) 尽可能避免引物自身分子之间3’端有较多碱基互补 上下游引物间二聚体(Cross Dimer) 尽可能避免上下游引物分子之间3’端有较多碱基互补 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 引物的特异性与保守性 特异性：避免非特异性扩增 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 用Blastn软件进行分析比较 扩增区域的二级结构 模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。 引物与PCR 引物浓度：一般为0.1-1μmol/L 引物浓度(uM)=n OD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2O VH2O (单位：L) 退火温度 最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 ×(Tm of primer) + 0.7 × (Tm of product) – 25 一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。 在0.2 mL Eppendorff管内配置50 μL反应体系： 反应物 体积（μL） dd H2O 35.5 PCR缓冲液 （10×） 5 MgCl2 （25 mmol/L） 4 dNTP （10 mol/L ） 2.5 Sense 引物（10μmol/L） 0.5 Anti-sense 引物 （10μmol/L） 0.5 Taq DNA聚合酶 1 模板DNA 1 引物与PCR 引物设计软件 Primer Premier 5.0 Primer 3 DNAman Oligo 如何使用Primer Premier 5.0 引物设计 一般PCR引物设计 （病原体检测） 带酶切位点引物设计（基因克隆） Realtime PCR引物设计 巢式PCR引物设计 多重PCR引物设计 探针设计 设计引物用于检测病例样本中是否存在结核杆菌感染 引物设计实例 Mycobacterium Tuberculosis Ag85a 获取目标序列