基因工程6.doc

一、大肠杆菌的基因工程 1大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子； SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成； 基因编码区5’ 端若干密码子的碱基序列 2密码子的偏爱性： 生物基因组中碱基含量：在富含AT的生物基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能规律 细胞内tRNA的含量 △外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略：外源基因全合成（根据偏爱性设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子）；同步表达相关tRNA编码基因（将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高表达的质粒上，构建双质粒系统。） 3大肠杆菌基因工程菌的构建策略 包涵体型异源蛋白的表达 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB 优点： 简化外源基因表达的产物的分离操作：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（具有生物活性）的目标蛋白，但变复性效率不高。 操作：如果非特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。 包涵体的溶解与变性：拆开错配的二硫键和次级键 复性与重叠：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠；形成次级键使蛋白质复性。 分泌型异源蛋白的表达 通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件 优点：目的蛋白稳定性高、易于分离且末端完整 缺点：外源基因在大肠杆菌中进行分泌表达效率低 构建：有些G-菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，依赖细菌素释放蛋白，激活定位于内上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上，即可构建完全分泌型的受体细胞，另取一携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，使用相同性质的启动子介导目的基因转录，实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。 融合型异源蛋白的表达 将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达，这种由杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。受体菌蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端，通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白。 优缺点：目的蛋白稳定性好、易于分离、表达率高、溶解性好；需要回收成本高。 构建： 受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特压抑性简单纯化。 外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子 两个结构基因拼接位点处的序列设计决定着融合蛋白的裂解工艺 两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。 目的蛋白的回收：将融合蛋白中的受体蛋白除去可选择化学断裂法（溴化氰与目的蛋白甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应）、酶促裂解法。 寡聚型异源蛋白的表达 通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量。是将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略。 优缺点：目的蛋白高效表达、稳定表达小分子短肽、产物回收困难 整合型异源蛋白的表达 DNA重组： 转位因子依赖型：转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子 同源序列依赖型：两个同源区距离越远、长度越长、同源性越高，重组概率就越高，包括整合（断裂一个位点）和交换（断裂两个位点） 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 4基因工程菌遗传不稳定性 （1）表现： 结构不稳定性（重组DNA分子上某一区域发生缺失