实验七酵母RNA的提取及鉴定.doc

姓名：郭沈杰 年级专业：2012级生物科学 同组者：蔡萍萍 学号：12050011012 实验七 酵母RNA的提取及鉴定 一、实验目的 掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。 用碱液提取的RNA有不同程度的降解。 三、实验仪器 1、离心机 2、水浴锅 3、电炉 4、烧杯 5、量筒 6、移液管 7、玻璃棒 8、滤纸 9、漏斗 10、试剂瓶 11、电子天平 12、pH试纸（pH1~14） 四、实验试剂 1、干酵母粉 2、0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 3、乙酸（A.R.） 4、95%乙醇 无水乙醚（A.R.） 6、10%硫酸：浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倾于水中，稀释至100ml。 7、氨水（A.R.） 8、5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 五、实验步骤 (一)RNA的提取： 1、称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~8ml氢氧化钠）。冷却，然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH试纸检验，pH5~6），离心10-15分钟（4000r.p.m）。 倒取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静置，待完全沉淀，过滤。 2、滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。 3、洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定和测定含量用。 （二）鉴定： 1、取上述RNA约0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1~2分钟，将RNA水解。 2、水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物。 注意事项： 1、离心管回收 2、离心的时候，要两两对称放置，且离心管中溶液的量基本一样。否则会遭成离心机转子的损坏。 六、实验结果 (一)RNA的提取： 加入乙酸使溶液呈酸性，溶液呈土黄色。 进行离心后，沉淀沉于离心管的下部，上半部分上清液呈土黄色。 取上清液，加入2倍体积的95%乙醇后，溶液呈现白色浑浊状 完全浑浊后，上清液呈白色，沉淀为白色。 过滤洗涤后，得RNA粗品。 （二）鉴定： （1）水解后，溶液呈无色透明状。 加入氨水后，溶液仍澄清，溶液中似有油状物质产生。 加入硝酸银后，仍似有油状物质产生。 一段时间后，产生白色絮状沉淀。 （2）取水解液0.5ml，加苔黑酚—三氯化铁试剂1ml，加热至沸1min，观察颜色变化 七、实验分析 称取干酵母粉：2.0096g 最后得到的RNA粗品：0.034 g RNA提取率（%）=RNA质量（g）/干酵母粉质量（g）x100% 本实验中RNA提取率（%）= 0.0346 g / 2.0096g = 1.722% （稀碱法提取的RNA为变性RNA） 本实验为定性实验，提取酵母中的RNA中，产生白色沉淀时可能因副反应产生的其他沉淀，即最终的沉淀中可能混有其他杂质，不适于进行定量测定。 依据：酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%~10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%~0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。 八、实验注意事项 1. 过滤时, 洗涤不能带水, 否则沉淀粘在滤纸上取不下来。 2. 有时絮状沉淀出现较慢, 可放十多分钟。 3. 利用等电点控制RNA析出时，应严格控pH。 4. 稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。 九、思考题 1、简述核酸分离纯化的一般原则。 保持核算一级结构的完整性； 尽量排除其他分子的污染，保持核酸纯度。 2、RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？ 过滤时，洗涤不能带水，否则沉淀粘在滤纸上取不下来； 有时絮状沉淀出现较慢，可放十多分钟； 利用等电点控制RNA析出时，应严格控制pH； 稀碱法提取的rna为变性rna，可用于单核苷酸制备，不能作为rna生物活性材料。 中国海洋大学实验报告 2013年11月27日