分子生物学第讲培训教案.pptVIP

三、阻遏蛋白与操作子的相互作用 （一）操作子上与阻遏蛋白结合的位点 1，lacI基因的表达特点 2，lac操作子（lacO）与阻遏蛋白的结合 （1）阻遏蛋白与lacO结合的实验证据 （2）lacO与阻遏蛋白结合的位点及其结构 A，DNA内切核酸酶消化实验证明：受阻遏蛋白保护区域位于-5 ~ +21(26bp) B，阻遏蛋白保护位点 C，lacO 的结构及其与阻遏蛋白的结合性质 3，阻遏蛋白对RNA聚合酶功能的影响 （1）阻遏蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合 （2）阻遏蛋白与DNA的结合能增强RNA聚合酶结合启动子的能力（RNA聚合酶与的平衡常数从1.9*107增加到2.5*109） （3）阻遏蛋白有效地使RNA聚合酶与lac启动子上形成一个很强的关闭式的转录起始复合物，阻止转录的起始 （4）阻遏蛋白的这种作用对操纵元的诱导也有促进意 4，上述模式不一定适用于其他系 （二）阻遏蛋白上与操作子结合的位点 1，阻遏蛋白单体的结构 （1）长头片段（long headpiece） （2）短头片段 （3）核心片段（core） （4）铰链区 2，阻遏蛋白四聚体的结构 3，阻遏蛋白与操作子的结合 4，阻遏蛋白需要组成四聚体才能实现完全的阻遏作用 （1） lac系统存在多个操作子 （2）阻遏蛋白四聚体可以同时与两个操作子结合 （3）阻遏蛋白结合第二个操作子影响阻遏的水平 （三）阻遏蛋白与操作子的解离 1，诱导物与操作子上的阻遏蛋白直接结合的证据 2，诱导物与阻遏蛋白的结合 3，阻遏蛋白与不同DNA的结合 （1）不同形式的阻遏蛋白与不同DNA结合的特异性 （2）细胞内阻遏蛋白的结合位点 （3）细胞内阻遏蛋白的存在 （四）影响阻遏蛋白与操作子相互作用的突变体 1，i-突变体 2，iS突变体 3，it突变体 4，i-d突变体 等位基因互补 5，Oc突变体 第四节 分解代谢产物抑制涉及的启动子正调控 一、分解代谢产物抑制 1，某些启动子转录的起始需要辅助蛋白质 某些启动子缺乏保守的RNA聚合酶识别位点（-35序列 / Sextama 框）和结合位点（-10序列 /Pribnow 框），需要辅助蛋白质参与转录的起始 最常见的是大肠杆菌对碳源利用有关的一组操纵元，受一种代谢产物激活蛋白（catabolite activator protein，CAP）控制，在葡萄糖存在时保证细菌优先利用葡萄糖 2，分解代谢产物抑制 含义：葡萄糖会引起许多操纵元（包括乳糖操纵元、半乳糖操纵元和阿拉伯糖操纵元）表达的阻遏 原因：葡萄糖引起cAMP含量下降，使分解代谢产物激活蛋白失活，从而抑制依赖该蛋白的利用其他碳源的代谢相关酶的表达 二、CAP对启动子的正调控 1，cAMP在分解代谢产物抑制中的作用 葡萄糖引起cAMP水平下降是分解代谢产物抑制的原因 cAMP由腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，cya）合成 cya基因突变体对葡萄糖变化没有反应 2，CAP的作用 （1）CAP的结构特征 CAP是同源二聚体，由两个22.5KD的亚基构成 CAP单体含DNA结合区及转录激活区 （2）CAP结合的DNA位点 CAP二聚体结合启动子中一个约22bp的序列 阻止CAP作用的突变位于保守的五核苷酸序列中（TGTGA），该序列可能是识别的必需成分 CAP与有两个（相反的）五核苷酸序列的位点结合最强，因为这样两个单体均可结合DNA 相对于RNA聚合酶的结合位点，CAP可以与不同的DNA位点结合 （3）CAP的激活 只有当cAMP存在时，CAP才具有活性 （4）CAP对转录的激活作用 A，CAP激活转录的途径 直接与RNA聚合酶作用 作用于DNA，以某种方式改变其结构以利于RNA聚合酶的结合 B，CAP与DNA和RNA聚合酶的作用 CAP二聚体结构保证了一个亚基可与RNA聚合酶接触，哪一个亚基以何种方向与DNA结合无关紧要 C，CAP对RNA聚合酶的作用取决于两者的相对位置： CAP位于启动子内部（如gal）时，可提高闭合复合物向开放复合物的转化速率 当CAP位于启动子临近位置（如lac）时，其主要作用是提高最初结合的速率，以形成开放复合物 第四节 操纵元的其他调控形式 一、具有双启动子的半乳糖操纵元 （一）半乳糖代谢 1，半乳糖代谢相关的酶 （1）半乳糖激酶 （2）半乳糖转移酶 （3）半乳糖表异构酶 2，代谢步骤 （1）半乳糖+ATP 半乳糖1-磷酸+ADP+H （2）半乳糖1-磷酸+UDPGlu UDPGal+葡萄糖1-磷酸 （3） UDPGal UDPGlu 总反应：半乳糖+ATP 葡萄糖1-磷酸+ADP+H （二）gal操纵元 1，gal操纵元组成 （1）结构基因（galK，galT，galE）