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第二节 基因操作的主要技术原理 凝胶电泳 扩增原理 分子杂交 DNA测序 生物芯片 1、基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。 DNA的迁移速率决定因素 1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖； 不同类型琼脂糖的性质 2、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶的特点 （一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性 （二）缺点 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 （2）琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1× TAE（TBE TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1μg，指示剂溴酚蓝 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 (5V/cm) （2）琼脂糖凝胶电泳的参数： 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）， 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比 操作 【注意事项】 1. 琼脂糖融化时，档位不宜太高。2. 制胶和加样过程中要防止气泡的产生。3. EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。4. 加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。5. 电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。6. 电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。7.溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位置。 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis ， 原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(N，N，N?，N?-tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。 （三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 图.1 夹心垂直板电泳槽示意图 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽7.冷凝系统 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）的原理 ：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(sodium