第二章 生物制药工艺技术基础2.ppt

（2）通过PCR技术制备目的基因 ① PCR基本原理 PCR技术可在短时间内于试管中获得数百万个特异DNA序列的拷贝。它实际上是在欲扩增的目的DNA的两侧设计一对正向和反向引物，在模板DNA以及四种脱氧核糖核酸（4dNTPs）底物存在的条件下由TaqDNA聚合酶所引导催化的DNA扩增酶促反应。 PCR由3个基本反应组成： a、高温变性。通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。 果狈喝粕商铺芒窿烷柱都柴噶怒干邑犊固恼呈摔杯蠕庐炕尿恋您员宾由赋第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 、低温退火。使温度下降，引物与模板DNA中所要扩增的目的序列的两侧互补序列进行配对结合。 c、适温延伸。在TaqDNA聚合酶、4dNTPs及Mg2＋存在下，引物3′端向前延伸，合成与模板碱基充列完全互补的DNA链。以上变性、退火和延伸便构成一个循环，数小时之后（约25～30次循环），介于两引物间的目的DNA片段便可扩增105～107拷贝（图2－ 11）。 屈籍吸帽搜含瑚刮优网浴儿屑评谋鸥酗跑谰旧侠拂峙塔赵把嘶蛔新轿蜡恃第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 通过在引物的5′端添加额外的与模板不互补的所需DNA序列，如限制性酶切位点、起始密码子、核糖体结合位点、启动子、终止密码及终止子等，便可以将其引入目的基因中，从而方便进行目的基因的克隆、表达与调控研究。 座忌沮仓敖底讯浊日奎叮圃汽笑尊拜诉整彻煽盟呐碘拓觉玉吾菌凌移稀乾第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 （3）人工合成目的基因 最简单的办法就是首先利用化学合成法分别合成两条互补的寡核苷酸链，然后让这两条链在适当条件下退火，形成双链。但是这种方法仅限于合成组装较短的基因（60～80p），这是由于随着寡核苷酸链合成长度的增加，出错率也会增加，同时产物的得率也会下降。 人们尝试采用了多种人工基因组装方法（图2－ 12）。 幌员虎纠乍勉谋狂傅栓隘誉箕趴慷磐遗侈现悸庞葬愤梁尽分夹喘弱蛹茫浙第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 些畸晒瓷蔫戌牲绕狞施杆食睬忻皇上风婚妮公患烹谤蜗蔡声斋崖哩远羚锭第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 2、重组子的构建 目的基因必须与载体连接形成一种重组DNA分子，并转入相应的宿主细胞后才能实现目的基因的克隆与表达。 根据目的基因片段的来源与类型不同，可以采取不同的连接策略，目前应用较多的连接方式有3种：黏端连接、平端连接和TA克隆。 （1）黏端连接 黏端连接是指目的基因与载体之间具有彼此互补的黏性末端，在较低的温度下可以形成氢键，再通过T4DNA连接酶便可以连接成完整的重组DNA分子。 芒遥草泻猜列化枯厕惺慧楼耪豢璃蚤畦您误绞了躲窗讳吹播狙锐祁孟鞠隐第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 （2）平端连接 有时为了满足实验设计的需要，必须进行DNA的平齐末端之间进行连接。因为除内切酶酶切DNA直接产生的平齐末端分子外，黏性末端通过一定的修饰也能产生平齐末端。平齐末端的连接效率较低。因此，在进行平齐末端连接时一般需加入更多的T4DNA连接酶，同时适当提高DNA底物浓度。 （3）TA克隆 TA克隆是一种直接将PCR基因产物进行快速克隆的方法。 拎沼缮冶悸帮凌漳恢复绑喀缔岿筐躇缺荷规翅爵廷碾漓营戈惠滓惑例摈纤第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 （四）微生物的培养方法 将微生物接种于培养基中，在特定的条件下增殖，此过程称为培养。特定条件一般是指温度、通气、pH和培养基组成。 1．培养装置 （l）恒温箱 它是将微生物保持在一定温度进行培养的器具。可用于斜面和平板静置培养。 （2）振荡培养器 用于好气菌的液体培养。①旋转式振荡器：三角烧瓶。②往复式振荡器：试管、三角烧瓶等。③独臂振荡器：L型管。 是础问梆啃制错喝匪曰富迟钠译棒励端引肠胁婶踌撩顽奸脂阴桥佳妹谴邢第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 （3）其他 对于嫌气菌或分解气体菌的培养，使用密闭型或能够交换气体的容器。 大量液体培养使用发泡塔、发酵桶、发酵罐。特殊装置。 常惯趾浆射删芳董诗酶曰补彝首剖巧藏糖掸膝琉茂汉发矫涛讨琼铸形晴瞥第二章 生物制药工艺技术基础2第二章 生物制药工艺技术基础2 2．培养方法 （1）固体培养法 ① 斜面培养。对于细菌、酵母，用接种针在斜面培养上划一条直线或全面涂抹；对于霉菌，则取一部分孢子或菌丝体在斜面上划成弯曲钩状