质粒转染后luciferase检测操作手册.docVIP

质粒转染后luciferase检测 操作手册 实验流程描述 培养生长状态良好的293T细胞，质粒转染前一天将细胞分入24-well培养板培养，转染当天按实验设计的组别进行质粒转染实验。转染24小时后荧光显微镜下观察细胞内荧光标记基因（如GFP）的表达情况，然后使用“Dual-Glo? Luciferase Assay System（E2920，promega）”试剂盒处理细胞、进行luciferase表达检测。 实验材料： 试剂 试剂名称 试剂来源 cat.No. 胎牛血清 FBS GIBCO DMEM GIBCO 胰酶 上海化学试剂公司 Opti-MEM Invitrogen Dual-Glo? Luciferase Assay Syste E2920 仪器 仪器名称 仪器来源 cat.No. 荧光显微镜 奥林帕斯 micropublisher 3.3RTV CO2培养箱 日本三洋 SANYO MCO-175 生物安全柜 上海振样创空气净化设备公司 Bio 1200-Ⅱ-A2 实验步骤： 1. 准备目的细胞 1.1 细胞复苏 1) 从液氮罐中取出细胞冻存管 2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 3) 完全解冻后，1000 rpm，离心2 min 4) 75%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 5) 吸去冻存液上清，加入1 ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 ml完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2 培养箱培养 6) 次日更换一次培养液后再继续培养 1.2 细胞传代 1) 将生长至90%汇合的细胞进行传代 2) 弃去旧培养液，加入2 ml灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞生长面，然后弃去该溶液 3) 加入1 ml胰酶消化液，37℃消化约1-2 min，直到细胞完全消化下来 4) 加入完全培养基2ml，用刻度吸管吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来 5) 混匀细胞后分至两个新的6-cm dish 中，补足完全培养基至4ml，继续培养 2. 目的细胞质粒转染 1) 将处于对数生长期的293T细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液 2) 将细胞悬液（细胞数约为4×105）接种于24-well培养板中，37℃、5%CO2培养箱培养至细胞融合度达到约80% 3) 根据invitrogen lipofectamine 2000转染试剂使用说明书进行转染操作： 将培液换成400 μl的opti-MEM培养基 每孔转染1 μg质粒、需要2 μl lipofectamine 2000，按照此比例，将质粒和lipofectamine 2000分别溶解于opti-MEM中，混匀，室温静置5 min 将b) 中稀释好的质粒和lipofectamine 2000混匀，室温静置 20 min 把质粒DNA与Lipofectamine 2000的混合液加入 293T 细胞中，37℃ 5%CO2 培养箱中培养5小时后，换成新鲜的含10%血清的完全培养基 4) 转染24小时后观察质粒上荧光标记基因的表达情况以判断转染效率，同时该过程用来平衡培养体系至室温下 3. luciferase检测 1) 初次使用Dual-Glo? Luciferase Assay kit时，需要将Dual-Glo? Luciferase Buffer和Dual-Glo? Stop Glo? Buffer提前数天放于室温下平衡；将Dual-Glo? Luciferase Buffer完全加入到Dual-Glo? Luciferase Substrate瓶中，完全溶解底物，形成Dual-Glo? Luciferase Reagent，分装保存于-70℃ 2) 24孔板中每孔去除250μl培养基，加入剩余体积同等量（即250μl）的Dual-Glo? Luciferase Reagent，室温反应10min以待细胞充分裂解，吹打混匀转移至1.5mL ep管中 3) 根据需要的量配制Dual-Glo? Stop Glo? Reagent待用（该试剂必须现配现用），如配制1.1mL Dual-Glo? Stop Glo? Reagent，即取11μl Dual-Glo? Stop Glo? Substrate加入到1089μl Dual-Glo? Stop Glo? Buffer中 4) 吸取100μl步骤2) 中的细胞裂解液 100μl于Lockwell maxisorp检测板中，酶标仪检测firefly luminescence（萤火虫荧光酶荧光值），该步骤在细胞经Dual-Glo? Luciferase Reagent裂解反应10min-2hours之内完成 5) 检测fi