EGFP在肿瘤细胞中的表达分析9.docVIP

EGFP在肿瘤细胞中的表达分析 黄娟 西南大学生命科学学院，重庆 400715 目录 摘 要 I Abstract III 第一章 文献综述 1 1.1 HTERT基因在肿瘤治疗中的研究进展 1 1.1.1 HTERT基因的发现 1 1.1.2 HTERT基因的结构和特征 1 1.2 HTERT基因在肿瘤治疗中的生物学意义 10 1.2.1 端粒与端粒酶 10 1.2.2 端粒酶与肿瘤的关系 10 1.2.3 针对端粒酶的抗肿瘤治疗 10 1.3 HTERT基因肿瘤在治疗中的研究进展 11 1.3.1 HTERT基因肿瘤治疗中的发展前景 13 1.3.2 HTERT基因在肿瘤在治疗中的存在的问题 13 1.3.3 HTERT基因在肿瘤治疗中的展望 13 第二章 引言 15 第三章 材料与方法 17 3.1 实验材料 17 3.1.1 实验动物 17 3.1.2 主要仪器与设备 17 3.1.3主要试剂、培养基和试剂盒 18 3.1.4 常用试剂及其配制 19 3.1.5 常用生物信息学网站和分析软件 20 3.2 实验方法 20 3.2.1 猪基因组DNA的提取 21 3.2.2 总RNA的提取及cDNA的制备 21 3.2.3 EST拼接和引物设计 22 3.2.4 PCR及PCR-RFLP分析 22 3.2.5 PCR产物的纯化、克隆和测序 24 3.2.6 印记分析 25 3.2.7 基因组织表达半定量分析 26 3.2.8 基因定位分析 26 第四章 结果与分析 29 4.1 基因组DNA的提取 29 4.2 总RNA的提取与cDNA的制备 29 4.2.1 总RNA的提取 29 4.2.2 cDNA的制备与检测 30 4.3 四个候选基因的克隆、印记鉴定与基因定位 30 4. 30 4.3.2 猪GTL2基因 34 4.3.3 猪RTL1基因 38 4.3.4 猪DIO3基因 38 第五章 讨论 38 5.1 印记基因的分离 38 5.2 印记基因表达的研究方法 38 5.2.1 基于“表达的SNP”的分析方法 38 5.2.2 应用品种间正反交模型分析印记基因的可行性 38 5.3 四个候选印记基因的表达状况 38 5.3.1 DLK1基因 38 5.3.2 GTL2基因 38 5.3.3 RTL1基因 38 5.3.4 DIO3基因 38 5.4 RTL1和DIO3基因的遗传定位 38 5.5 印记基因与动物遗传育种 38 参考文献 38 致谢 38 发表论文及参加课题一览表 38 摘要：【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP)质粒载体，通过将启动子置换成端粒酶（HTERT）启动子，使其能在肿瘤细胞中特异性的表达，观察EGFP的表达情况以及对靶细胞生物活性的特异性的影响。【方法】以质粒pEGFP-N3为模板进行PCR反应获得完整保留pEGFP-N3的多克隆酶切位点的EGFP基因片段，定向插入更换启动子的pLenti6V5DTop质粒中，其启动子由原来的PCMV置换为HTERT启动子，筛选出正确的重组绿色荧光蛋白基因的重组载体pLenti6V5DTop-EGFP，在阳离子脂质体的作用下导入肿瘤细胞后，获得具有绿色荧光蛋白颗粒的表达产物，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白作为目的基因在体外的表达情况，以及对肿瘤细胞生物活性的影响。【结果】成功克隆携带有EGFP基因的载体，该载体经导入人的肿瘤细胞后产生稳定的表达产物。 关键词：EGFP基因；pLenti6V5DTop质粒载体；HTERT启动子；pLenti6V5DTop-EGFP；导入；人体肿瘤细胞 EGFP genes expression and analysis in cancer cell of human juan huang School of Life Science, Southwest China University, Chongqing 400715, China Abstract:【objective】to construct the plasmid carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP)gene and to observe the expression of green fluorescent proteinin in human cancer cells.【methods】【results】【conclusion】 Key words:green fluorescent protein (EGFP)gene ;pLenti6V5DTop plasmid ;HTERT promoter;translate;human cancer cell