HSC分离方法.docVIP

分离实质细胞和肝星状细胞实验步骤： 1.饥饿处理 在分离前24 h。麻醉 戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉。 . 手术 以“U”型切口打开腹腔。将肠管推向腹腔左侧，暴露门静脉及下腔静脉，将充满前灌流液的插入门静脉。 灌流 打开恒流泵的开关开始灌流，并迅速剪断下腔静脉。GBSS（不含Ca2+、Mg2+，pH7.4）肝门静脉灌流冲掉血细胞，流速7mlX5min。待冲出液为无色时，换含0.16mg/mL collagenase IV和0.02mg/mL Dnase I以7ml/min速度灌流10min，将肝内结缔组织破坏。当肝脏变白变软后，摘下肝。 5. 细胞悬液的制备 2mm3的小块，含0.16mg/mL collagenase IV和0.04mg/mL Dnase I的GBSS（含Ca2+、Mg2+，pH7.4）37度温和震荡消化20-30min，反应以FBS终止。得到的单细胞悬液依次通过200目尼龙网和300目尼龙网，除去没有消化完全的组织块。 6. 肝细胞的分离 50g，3min，2次），得肝实质细胞。将肝实质细胞沉淀悬于密度为1.06g/mL的梯度液，4度50g离心10min，得到的沉淀为肝实质细胞。小心吸出上层液体，沉淀以PBS 50g 3min洗2次。 7. 肝星状细胞的分离 400g 4度离心10min得到沉淀主要为非实质细胞。沉淀以含BSA和0.02mg/mL Dnase I的GBSS（不含Ca2+、Mg2+）洗一次。沉淀溶解于5mL 15%Optiprep，上层小心铺10%Optiprep后1400g 4度离心17min。10%上方为HSC，15%和10%界面之间主要为内皮细胞和枯否细胞。小心吸取出10%界面以上细胞，400g 4度离心10min。用GBSS（不含Ca2+、Mg2+，pH7.4）洗一次之后，得到HSC。 得到星形细胞分别通过密度为1.089g/mL的梯度进行纯化，1400g 10min，收集上层细胞，除去破碎细胞和各种杂质。 试验流程 暴露门静脉，前灌流液灌流（37 ℃） ml/min 5～8 min 0.16mg/mL collagenase IV和0.02mg/mL Dnase I（37 ℃） ml/min 10min 剪碎肝脏，加0.16mg/mL collagenase IV0.04mg/mL Dnase I的GBSS 50ml，震荡min 两层纱布过滤至两个ml离心管中 min离心 10% optiprep 密度梯度1400g 17min离心 取 DNA酶I和细胞悬液间界面细胞，00 rpm 10min 沉淀加适当重悬 ℃孵育30分钟，洗3次。℃孵育30分钟，洗3次。