MYB基因表达载体构建及遗传转化.doc

1 MYB1、MYB2基因正反义序列的扩增 以cDNA为模板，分别用已加入酶切位点的正、反义全长基因引物扩增序列，PCR 反应体系如下： c DNA（2.5 ng/μl） 1μl Primer 1（10μM ） 2μl Primer 2（10μM） 2μl 2×PCR Mix 25μl dd H2O 补足至50μl 反应条件95℃ 3 min95℃ 30 sec；MYB1的Tm=60℃；MYB2的Tm=55℃ 30 sec ；32 Cycles；72℃ 90 sec；72℃ 10min。 PCR产物用0.1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出MYB1 800bp、MYB2 600bp左右的片段，用TANGEN公司大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。将回收的产物与Takara公司的pEASY-T1载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单菌落进行PCR检测，阳性克隆送Invitrogen测序，经测序正反向序列无移码或突变发生。 2 正反义表达载体PBI121-senseMYB1、PBI121-antiMYB1、PBI121-senseMYB2的构建 分别提取pEASYT1-senseMYB1、pEASYT1-antiMYB1、pEASYT1-senseMYB2和PBI121质粒，电泳检测其亮度。各取50μl质粒，MYB1正反义、PBI121用BamHI/EcoRI进行双酶切，MYB2正义、PBI121用BamHI/XbaI进行双酶切，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。对pEASYT1-senseMYB1、pEASYT1-antiMYB1、pEASYT1-senseMYB2质粒酶切后的小片段和PBI121质粒酶切后的大片段进行回收并连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，对具有抗Kana的单菌落进行菌落PCR检测。阳性克隆送公司测序，进一步确定正反义序列无移码或突变发生，并且插入的方向正确。 3 表达载体转化农杆菌 表达载体公司测序正确，将鉴定正确的重组表达载体质粒用冻融法分别转化感受态农杆菌EHA105，经含有Kan（50mg/L）和Rif（50mg/L）的固体LB培养基筛选，挑取培养好的单菌落，摇菌，提取农杆菌转化子质粒DNA。农杆菌转化子质粒DNA再次用PCR方法进行鉴定，将鉴定为阳性的单菌落菌液保存于-70℃，备用。 4 农杆菌介导转化烟草 本实验用叶盘转化法，分别将pEASYT1-senseMYB1、pEASYT1-antiMYB1、pEASYT1-senseMYB2、PART、MYB-PART干涉质粒转化烟草叶片。阳性转基因植株正在筛选中。 5 基因的克隆 建立了蜡梅花各时期的转录组文库，并构建了中内被片的表达图谱，分析筛选基因的差异表达，充分利用文库克隆目标基因。用Tail PCR 或RACE扩增出以下全长，并用Pfam、ExPASy、PlantTDF、clustalx2、Mega等进行生物信息学分析。 编号 功能预测 ORF 蛋白保守域 实验进展 Cp99881 未知 1035bp Myb-like DNA-binding domain 正构建超表 Cp37378 抗寒HOS15/ 色素合成1737bp WD or beta-transducin repeat 正构建超表、克隆启动子 Cp32549 查尔酮合成类似/角质层蜡质1602bp FAE1/Type III polyketide synthase-like protein;3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein (ACP)] synthase III C terminal 正构建超表 Cp61803 转录组库注释错误，不属于MYB家族 不存在保守结构域 可继续验证其功能 Cp56471 Transcription repressor MYB5 1689bp Myb-like DNA-binding domain (41-139aa) 克隆出全长 编号 功能预测 ORF 蛋白保守域 实验进展 Cp58811 Alcohol dehydrogenase transcription factor Myb 2202 含有两个Myb/SANT-like DNA-binding domain 已克隆出全长 Cp49846 MYBTF可调控 DUO pollen 已克隆出2061bp, 不存在保守结构域 无终止子，3端需继续扩增