不同类型细胞的培养特点课件.ppt

3．消化排除法： (1) 先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA (1:1) 混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化； (2) 把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。 4．胶原酶消化法： 本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。 (1) 可用0．5mg／ml 的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化； (2) 用Hanks 洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞末被除净，可再次重复。 5．其它方法： 有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025 ~ 1.085 的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中800g 离心10 分钟。在比重1.025 ~ 1.050 层为成纤维细胞，在比重1.065 ~ 1.085 层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD 抑制成纤维细胞生长的方法。 选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。 二、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施 1．适宜底物： 如：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。 2．生长因子： 应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。 3．动物体媒介培养： 为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞(干细胞) 的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。 Hela细胞 肝癌细胞 人乳腺癌细胞株MCF-7 * embryonic stem cell, ES 二、结缔组织类细胞培养 (一) 成纤维细胞培养 包括人在内的各种成纤维细胞都很容易培养，也是其它组织培养时的副产物，极易获得。 用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，去头和内脏，剪成小碎块后，用胰蛋白酶消化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。 小鼠成纤维细胞培养条件 12.5~14.5d胎龄的小鼠胎儿分离效果最好； 最佳培养基为DMEM添加15%小牛血清； 第3代细胞增殖最旺盛； 室温条件下，0.125%胰蛋白酶消化时间以8~10min为宜。 在培养ES细胞时，应选择第3~5代的小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。 小鼠成纤维细胞；细胞来源：swiss小鼠胚胎 (二) 巨噬细胞培养 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。 巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活2 ~ 3周，因之多用作初代培养。 巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如P388D-1、J774A．1、RAW309、Cr. 1 等。 1．培养技术要点： [来源和取材] 巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。 实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。用40μg 的PHA 注入腹腔中，能产生6 ~ 8×106 个细胞，而且无刺激性，效果较好。 2．培养方法： 培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞，其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同外，培养方法大同小异。 [程序] (1) 实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫基乙酸肉汤1ml (勿注入肠内)； (2) 引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3 ~ 5 秒； (3) 置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁； (4) 再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动； (5) 用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内； (6) 小心拔出针头，把液体注入离心管中， (4℃)离心10 分钟后，去上清，加10 ml Eagle 培养基； (7) 计数细胞，每只小鼠可产生20 ~ 30×106 细胞，其中90％为巨噬细胞； (8) 为获取3×105 个贴附细胞／平方厘米，需接种2.5×106／m1； (9) 为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle 液冲洗1 ~ 2 次后，再加新Eagle 培养液置37℃ CO2