TCID50的测定方法.doc

实验 病毒感染力的滴定（TCID50的测定） 在半定量或定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱。 滴度（抗体的多少）越高，受传染的机会就越小一、实验目的 了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法 半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测 半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测 半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测 蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测三、材料 1、长满单层的细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步骤 1、在离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-。 2、将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100μl。 3、在每孔加入细胞悬液100μl，使细胞量达到2~3×105个/ml。4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100μl生长液+100μl细胞悬液） 5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。 6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCID50的计算方法 1、Reed-Muench两氏法病毒液稀释度 出现CPE孔数 无CPE孔数 累 计 出现CPE孔所占的% CPE孔数 无CPE孔数 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10-2 8 0 19 0 100（19/19） 10-3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10-4 3 5 4 6 40（4/10） 10-5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10-6 0 8 0 21 0（0/21） CPE：Cytopathic effect距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数） ? ＝（91.6-50）/（91.6-40） ＝ 0.8 lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 =0.8×(-1)+(-3) =-3.8 TCID50=10-3.8/0.1ml 含义：将该病毒稀释103.8接种100μl可使50%的细胞发生病变。2、Karber法病毒液稀释度 出现CPE的孔数 出现CPE孔的比率 10-1 8 8/8=1 10-2 8 8/8=1 10-3 7 7/8=0.875 10-4 3 3/8=0.375 10-5 1 1/8=0.125 10-6 0 0/8=0 lgTCID50=L-(S-0.5) L：最高稀释度的对数 D：稀释度对数之间的差 S：阳性孔比率总和 lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5) =-3.875 TCID50=10-3.875/0.1ml 含义：将该病毒稀释103.875接种100μl可使50%的细胞发生病变。