一种新的可放大的重组腺病毒载体的纯化方法.docVIP

A New Scalable Method for the Purification of Recombinant Adenovirus Vectors 一种新的可放大的重组腺病毒载体的纯化方法 摘要：重组腺病毒是各种基因治疗的首选载体。但是，这种载体的规模化发展的生产和安全性依然是个挑战。另外，对于这种载体，任何环节都必须有充分的证据来确定其的免疫性和毒性。很多可供选择的在柱层析的基础上再用经典的CsCl梯度离心纯化的方法已经形成了，但是第一代的纯化过程在潜在的应用方面还是有一定的缺陷。本文报道的是一种将两种树脂层析柱串联的协同作用的方法来纯化腺病毒，分别为anion-exchange（离子交换柱）和PolyFlo柱。PolyFlo柱起到的作用是去除离子交换柱不能除去的宿主细胞蛋白和病毒蛋白。以β-半乳糖苷酶做报告基因的腺病毒载体，H5.CMV-lacZ，过高效液相色谱（HPLC），SDS-PASGE（银染）,Western分析，电子显微镜，VP：IU等分析方法，分别与单纯的2×CsCl密度离心纯化法和离子交换法进行比较，发现两步串联法的提纯的腺病毒载体纯度更高。另外，腺病毒的回收率比2×CsCl离心纯化法明显高，并且远远高于第一代的离子交换法。并且整个过程可以再生和放大，每次过柱的进样量为可达到1015的病毒颗粒。更重要的是，这种方法纯化的腺病毒在4℃，-20℃，-75℃，可以保持稳定，在多轮的反复冻融后依然完整。最后，这种方法纯化的病毒纯度高，易放大，不用离心。 本文整体总结（overview summary） 重组腺病毒是非常有前景的基因转染系统，因为其高效的瞬时基因表达能力和高效的转染能力而被用于基因治疗。但是，如何生产大量的高纯的成规模的能满足临床评估和产量的纯化方法确成为一个重要的问题。我们研发的一种串联层析柱的方法能够提高重组腺病毒的纯化，在本文中将从纯度、安全性、完整性、功能性（效价）和规模化等方面证明它的纯化过程。 简介（introduction） 在过去的10年中，重组腺病毒（rAd）载体在基因治疗领域引起人们极大的兴趣。它在活体内具有高效的转基因能力，能够转染各种野生型细胞，包括需要非常高基因表达能力的造血干（祖）细胞。但是，目前的一些研究表明病毒载体或者表达的基因产物能够引起对细胞和人体的免疫反应，这些会增加毒性和免疫原性。这会削弱重组基因的表达从而降低腺病毒载体的基因治疗效果。 纯化过程中残余的病毒成份会引起炎症反应，而这些免疫反应或许随后就开始启动。特别的是，最近的研究证明，当把整个腺病毒的一个组份或者游离的蛋白在人体内出现时，腺它以一种剂量依赖的方式类似一种佐剂而引起免疫反应。所以，近年来在腺病毒领域的发展主要集中在腺病毒和生产过程的改进，以使毒性最小化和减少免疫反应，从而提高转基因的表达效果和稳定性。 为了改进腺病毒的生产，研发可放大的纯化方法有了新的突破。Huyghe等发明的方法是首先使用离子交换柱粗纯化病毒，然后再用固定化金属离子层析（IMAC）作为精纯化病毒。Blanche等通过单独或者循环使用离子交换柱生产高质量的腺病毒。这些第一代的柱层析法在纯度和产量方面弥补了2×CsCl密度离心纯化法的不足。但是作为一种基础的化学纯化技术的这种第一代的柱层析法在生产腺病毒的纯度方面却不能与2×CsCl密度离心纯化法相媲美甚至不能比它更好。所以在第一代柱层析法的基础上还需要精纯化。在这些关于纯化的文献中最大规模病毒颗粒承载量只有为1013，最后产品的回收率也非常低，在Huyghe的方法中大约只有32％，在Blanche的方法只有40％。如此同时，很多出现在国家会议或者公司的专利中的一些纯化方法，依然有很多局限性。 实验总是引导改进腺病毒的纯化方法。我们发明了一种串联层析柱法，第一步利用离子层析法吸附病毒，第二步再用PolyFlo层析柱来进行精纯化。实验的结果表明，PolyFlo层析柱能够区分细胞蛋白、游离的病毒蛋白碎片与完整的病毒颗粒，从而能够去除这些在离子交换法(第一步)中不能去除杂质。通过不同的病毒收获方法，从纯度、可放大性、再次利用方面对这种串联纯化法进行评估。 一． 实验方法简译 1. 待纯化的病毒悬液的制备 病毒是E1/E4缺失的rAdH5.CMV-lacZ，用于扩增病毒的是HEK-293细胞，以不同的MOI将病毒加入到细胞中，感染过程持续2-5天后收获。由于病毒的扩增方法有不同，病毒的释放方式有两种。一种是染毒5天后收集全部液体，处理后用柱层法纯化，方法见后。一种是染毒后2-4天收集细胞悬液离心后，细胞沉淀层用PBS洗一次，然后反复冻融3次，重悬，先用1.2um过滤，再用0.2um过滤，病毒悬液保存在-75℃备用。 2. 细胞完全自然破裂的病毒溶解物澄清液的制备 病