下一代DNA测序技术研究进展综述.doc

深度DNA测序技术在基因组测序中的研究策略和进展 DNA测序技术的发展过程漫长而艰辛，然而，我们现在获取的大部分DNA序列信息还是依靠基于Sanger在1977年建立的“DNA双脱氧链末端终止测序法”的DNA测序技术获得的。另外就是Maxam和Gilbert建立的“化学降解测序法”。在过去的七年当中，DNA测序技术的发展至少受到来自四个方面的影响：首先是人类基因组计划的出现，这项计划的实施过程中，科学家们面临了巨大的经费问题，因为传统的Sanger测序法无论怎么优化，都无法大幅度降低测序的成本，这很大程度促进了人们对在测序过程中如何降低成本的技术方面的研究。第二，人类以及其他主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段阅读（short-read）成为可能,这极大的促进了短片段测序技术的发展。第三，新型分子生物学技术的不断涌现导致了越来越多的诸如RNA表达染色体构象等生物现象的出现，这就需要有高通量DNA测序手段去解释这些问题，这也极大的促进了新型测序技术的发展。第四，其他学科领域的技术的发展，例如计算机技术，数据存储及分析技术，聚合酶工程技术等，极大地支持了DNA测序技术的应用。本文主要是对目前新一代DNA测序（也叫深度测序）技术（Next-generation DNA sequencing technologies）的研究策略及目前国际DNA测序最新进展做一简要的综述。 Sanger测序法 先来回顾一下经典的DNA测序法，从上世纪九十年代早期开始，几乎所有的DNA测序都是利用半自动化的毛细管电泳Sanger测序技术完成的（图1-a）。后来出现了高通量测序法，这种方法首先要对DNA预处理，获取大量的待测序模板即质粒或PCR产物。然后在测序一种发生测序生化反应，这个过程会产生大量长短不一（因为终止位点不一样），末端被荧光标记的延伸产物。再用分辨率高的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，利用计算机软件自动“读出”DNA序列。但这种方法读取的碱基信息有可能是错的。这种方法可以应用于序列分析，例如基因组组装或者找到突变位点，这很大程度取决于测什么和为什么测。这种高通量的测序方法一般可以同时进行96或者384个样品的测定。经过三十年的逐步发展，Sanger测序法达到了对1000bp长的序列进行测序，并且每个碱基的准确度可以达到99.999%。在高通量的鸟枪基因组测序中，每测一千个碱基就要花费0.50美元。 图1.传统的测序与新一代测序法的流程比较 a.高通量鸟枪Sanger测序法，首先，基因组DNA被随机切成小片段分子，然后将小片段DNA克隆进质粒载体，再转化到大肠杆菌中，最后从培养的大肠杆菌中提取质粒测序。在几微升的反应体系中完成测序反应，然后通过延伸产物的末端荧光标记进行识别来进行DNA序列读取。b.鸟枪循环芯片测序法。同样先将基因组DNA随机切割成小片段，然后在这些小片段DNA分子的末端连接上普通接头，制成polony芯片，每一个polony都含有一个小片段DNA分子的多个拷贝，很多个polony集合在一起就形成了一个polony芯片。这样的话，一次测序反应中就可以同时对多个polony进行测序，后面就与Sanger测序法一样，获得完整的DNA序列。 2. 深度DNA测序法 各种不同的DNA测序策略可以被归为以下四类：a.微电泳方法，b.杂交法，c.单个分子的实时观测测序法，d.循环阵列测序法。在此，主要以二代测序法对照在各种商业产品（如454测序法（主要应用在454基因组测序仪中），Solexa技术（用于Illumina测序仪中），SOLiD平台（Applied Biosystems）,Polonator测序仪Heliscope单分子测序仪。）（表1）的循环阵列测序法简述一下。循环阵列测序法可以简单的描述为：对充满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应操作和碱基成像数据收集。2005年Science和Nature各有一篇文章详细报道了这种方法，由于这种方法相对于传统的测序方法速度更快，成本更低，因此，在之后的几年中，这种方法被人们广泛的应用。 表1.各种测序技术 Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2009.10:135–51 尽管这些测序平台在在实际的生产及操作过程很不相同，而且各有特点，但他们的背后的工作原理是很相似的（图1-b）。新一代测序法第一步也是将基因组DNA随机切割成小片段DNA，然后在这些小片段DNA分子的末端连接上普通接头，也可以制成跨步文库（jumping library）,然后使用原位polony(situ polonies),微乳液PCR（Emulsion PCR）或桥式PCR（Bridge PCR）等