第6讲植物细胞代谢产物制备I.pptVIP

内容安排 Ⅰ：植物细胞培养 Ⅱ：植物细胞培生产次级代谢产物的应用举例分析与讨论 Ⅲ：植物组织培养及应用举例分析 一 植物细胞培养的定义 植物细胞培养（Plant cell culture）是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。 获得的细胞群体可以作为制备有价值代谢产物的原料，也可以作为基础研究的材料。 同时植物细胞培养技术也是人工种子、原生质体培养、花药培养等的支撑技术。 二 植物细胞特点 三 植物细胞培养历史 20世纪50年代，泰尔克（Talecke）和尼克尔（Nickell）证实植物细胞可生长在悬浮培养液中。 随后，人们发现离体培养的植物细胞具有合成代谢产物的能力。1956年，尼克尔（Nickell）和卢荻（Routin）申请了第一个用植物细胞培养生产化学物质的专利。 20世纪80年代后期，紫草宁等细胞培养生产获得了产业化（紫草宁可以用作创伤、烧伤以及痔疮的治疗药）。 四 植物细胞培养技术 （一）培养基 植物细胞培养的培养基主要由碳源、氮源、无机盐、维生素、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。目前应用广泛的基础培养基有MS、B5、N6等。 问题2：植物组织培养的培养基组成有哪些？ 无机盐：大量元素N\S\P\K\Ca\Mg等、微量元素 有机物：糖类、氨基酸、维生素等 调节物质：激素 与微生物培养基相比：需要大量无机盐；多种维生素和激素；一般采用无机氮源；一般以蔗糖为碳源。 （二）植物单细胞分离与初步培养 植物细胞培养首先需要从植物样品制备单细胞 问题3：植物组织培养、细胞融合时单个植物细胞是如何获得的？ 1.由完整的植物器官分离单细胞 （1）酶解法 选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质（纤维素、果胶、多糖）降解，从而使细胞彼此分开，这种方法称为酶解法。 经常采用的生物酶包括：纤维素酶、果胶酶等。 （2）机械法 第一种方法：用刀片刮叶片 2.由愈伤组织分离单细胞 通过培养植物外植体诱导产生愈伤组织，并使其大量增殖，再通过机械震荡或者酶解的方法使细胞分离从而获得游离的细胞。 细胞平板培养 概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。 主要技术要点：? 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择合适。? 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×105/ml。 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm。待植板后的培养基完全凝固后，用石蜡或封口膜将培养皿封严以防污染，在25℃黑暗条件下培养3周即可长出肉眼可见的细胞团。 看护培养nursing culture） 用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。这块愈伤组织被称为看护组织。由缪尔（Muir）于1953年创立。 具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。优点是：简便、成功率高。缺点是不能在显微镜下直接观察。 微室培养 概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。 饲养层培养（Feeder layer culture） 把处理过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。 （三）继代培养 1.固体培养 平板培养法是经常采用的一种固体培养方式，将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基（含琼脂Agar）的培养皿内进行培养。类似于微生物细胞的平板培养，具体步骤包括：单细胞悬浮液的制备、计数、调节细胞密度、培养基选择、浇平板、接种培养。 2.液体培养 采用液体培养基进行细胞培养。 （四）植物细胞悬浮培养 悬浮培养的生物反应器 ?? 一般所说的生物反应器是指细胞培养生物反应器，是为细胞生长提供合适的化学与物理环境并能检测控制细胞生长的装置。 一般都有三部分组成：反应罐、控制系统、检测分析系统。 问题4.与传统微生物发酵罐相比，植物细胞培养的生物反应器有什么特点？ 植物细胞培养的特殊要求 植物细胞培养反应器最初大多采用微生物反应器。由于植物细胞与微生物细胞形态结构不同，植物细胞较微生物细胞大，对剪切力耐受性差，而且对氧的要求相对微生物要低得多，因此微生物反应器并不完全适合于植物细胞生长与生产。 植物细胞培养具有周期长、细胞抗剪切能力弱、易团聚等特点。同时，植物细胞规模培养的目的是生产天然产物，而这些天然产物均为细胞次生代谢物。所以，植物细胞培养反应器的设计，不仅要考虑有利于细胞生长，同时还要考虑有利于产物的积累和分离。总体上讲，适合植物细胞的反应器应该具有适