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基因芯片（DNA芯片） 三峡大学医学院 盛 德 乔 shengdq@ctgu.edu.cn 基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。 由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。DNA芯片又被称为基因芯片（gene chips）、DNA阵列（DNA array）、cDNA芯片（cDNA chips）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）等。 基因芯片 DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。 通常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片 。 DNA芯片为生物芯片的一种： 生物芯片包括： DNA芯片 蛋白质芯片 组织芯片 糖芯片…… 基因芯片分析的优点 快速 高通量(104 - 106) 自动化 使用的试剂少 低成本 DNA芯片的主要类型 按制备方式分： 原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短 DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活 按用途分 样品制备芯片 生化反应芯片 检测芯片 芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标 原位合成(In Situ Synthesis) DNA芯片技术的基本原理与方法 芯片的制备 芯片制备的基本原理。 芯片的制备包括支持物的预处理、原位合成芯片的准备和DNA微集陈列的制备三个方面。 支持物的预处理 目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分为两类：实性材料和膜性材料。 实性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。 膜性材料有聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维素膜等。 实性材料需要进行预处理，使其表面衍生出羟基、氨基等活性基团。在合成寡核苷酸前，这些基因可与光敏材料的光敏保护基团形成共价交联而被保护起来，合成时在光照下除去光敏保护基团，该活性基团又可以和活化的单核苷酸发生化学反应。另一方面，这些活性基团可与DNA分子中的羟基等基团形成共价结合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚赖氨酸等，使其带上正电荷吸附带负电荷的DNA探针。 原位合成芯片的制备 原位合成芯片是采用显微光蚀刻（photolithography）技术或压电打印（piezoelectric printing）技术，在芯片的特定区域原位合成寡核苷酸而制成。 DNA微集陈列的制备 DNA微集陈列的制备采用的是预先合成DNA或制备基因探针然后打印到芯片上的方式。 二、样品的准备 样品的准备包括样品的分离纯化、扩增和标记等过程。 样品的分离纯化 主要从活组织或血液中获得DNA或mRNA，这个过程包括细胞分离，破裂，去蛋白，提取及纯化核酸的过程。 样品的扩增 测定时往往需要较多的样品分子，因此对于分离获得的基因组DNA通过PCR技术直接扩增，对于mRNA则需要逆转录，制备cDNA。 样品的标记 标记物主要有荧光分子（Cy3、Cy5）、生物素以及放射性同位素等。带有标记的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通过DNA或cDNA扩增的过程，掺入靶分子序列。也可以在制备引物时，掺入标记的核苷酸，扩增靶序列后，使扩增产物末端带有标记物。膜性载体可以用于检测同位素标记的样品。 样品分子标记的质量影响芯片检测的灵敏度，因此，核酸的提取，反转录以及标记等各环节要求严格操作。 三、分子杂交 芯片杂交是应用标记的待测样品（靶序列）与固定在载体表面的探针进行的复杂过程。 依据探针长度、类型以及不同的目的，确定温度、盐浓度与反应时间。通常采用的条件是：42℃，50%甲酰胺，6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt试剂。 杂交过程类似Northern或Southern杂交，如封闭液预杂交、杂交、清洗、干燥与检测。 四、检测分析 芯片杂交信号的检测可应用荧光检测法、质谱法、化学发光法、光导纤维法以及生物传感器法。 其中激光共聚焦荧光检测法是最常应用的方法：激光从芯片的背面切入，聚焦于芯片与靶溶液的相互作用面，与探针杂交的靶序列标记物被激发产生荧光，经过棱镜聚焦而被检测器检测。样品靶序列与探针严格配对杂交的分子发生强荧光信号，不完