第四章猪的常见寄生虫病.pptVIP

三、免疫酶技术 1.基本原理 免疫酶技术是继免疫荧光 技术之后发展起来的又一 种免疫标记技术，是根据 抗原与抗体特异性结合， 以酶作标记物，酶对底物 具有高效催化作用的原理 而建立的。 酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性。酶标抗体或抗原与相应的抗原或抗体结合后，形成酶标抗体—抗原复合物。复合物中的酶在遇到相应的底物时，催化底物分解，使供氢体氧化而生成有色物质。 有色物质的出现，客观地反映了酶的存在。根据有色产物的有无及其浓度，即可间接推测被检抗原或抗体是否存在以及其数量，从而达到定性或定量的目的 免疫酶技术在方法上分为 两类，一类用于组织细胞 中的抗原或抗体成分检测 和定位，称为免疫酶组织 化学或免疫酶染色法，另 一类用于检测液体中可溶 性抗原或抗体成分，称为 免疫酶测定法 免疫酶染色法是标本制备 后，先将内源酶抑制，然 后进行免疫酶染色检查。 其基本原理和方法与荧光 抗体法相同，只是以酶代 替荧光素作为标记物，并 以底物产生有色产物为标 志。常规免疫酶染色法可 分为直接和间接两种方法 真接法 是用酶标记特异性抗体，直接检测寄生虫或其抗原。在含有寄生虫或其抗原的 标本固定后，消除其中的 内源性酶，用酶标记的抗 体直接处理，使标本中的 抗原与酶标抗体结合，然 后加底物显色，进行镜检 间接法 是将含有寄生虫或其抗原 的组织或细胞标本，用特异 性抗体处理，使抗原抗体结合，洗涤清除未结合的部分，再用酶标记的抗抗体进行处理，使其形成抗原—抗体— 酶标记抗抗体复合物，最后 滴加底物显色，进行镜检 间接法虽然多一步骤，但比直接法特异性强，使用范围广。酶标记第二抗体可用葡萄球菌A蛋白SPA或生物素与亲合素系统等代替，亦成功地用于许多抗原和抗体的检测。同时，在不同程度上提高了检测方法的特异性与敏感性 免疫酶测定法分固相免 疫酶测定法和均相免疫 酶测定法两类 固相免疫酶测定法 是需用固相载体，以化学的或物理的方法将抗原或抗体连接其上，制成免疫吸附剂，随后进行免疫酶测定。酶联免疫吸附试验(ELISA)是固相免疫酶测定法中应用最广泛的一种 均相免疫测定法 不需将游离的和结合的酶标记物分离，也不需载体，直接从溶液中测定结果。本法主要用于激素、抗生素等小分子半抗原的检测 2.用于标记的酶及其底物 应用较多的有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和β半乳糖苷酶等，其中以辣根过氧化物酶应用最广 3.酶标抗体 酶标抗体可直接购自生物 试剂公司，亦可实验室标 记。抗体的酶标记中，酶 的活性和纯度至关重要。 抗体也要求纯化程度高， 最好用亲和层析纯化，但 在单抗标记中也可直接标 记小鼠的腹水。 理想的结合剂应具备生产 率高，结合物稳定，不影 响酶的活性和抗体的活性，不产生干扰物质、操作简 便等条件。目前主要采用 戊二醛标记法和过碘酸钠 标记法 戊二醛标记法的原理是通 过它的醛基与免疫球蛋白 上的氨基共价结合，即戊 二醛上的两个活性醛基， 一个与酶分子上的氨基结 合，另一个与免疫示蛋白 上氨基结合，形成一个酶 —戊二醛—免疫球蛋白结 合物。标记过程可参见有 关免疫学书籍 过碘酸钠法主要用于HRP 的标记。优点是标记率高， 未标记的抗体量少，但结 合物分子量较大，穿透细 胞的能力不如用戊二醛法 标记的抗体，故不适于在 免疫电镜中应用。标记过 程可参见有关免疫学书籍 4.免疫酶染色法 * 第二节 免疫学诊断方法 已报道的寄生虫免疫学诊 断方法很多，包括变态反应、沉淀反应、凝集反应、补体 结合试验，免疫荧光抗体技术、免疫酶技术、放射免疫 分析技术、免疫印迹技术等。此处仅介绍主要几种 一、间接血凝试验 1.基本原理 间接血凝试验(Indirect heamagglutination assay， IHA)是凝集试验的一种。 抗原与相应抗体结合形成复合物，在电解质存在下，复合物相互凝集形成肉眼可见的凝集小块或沉淀物。根据是否产生凝集现象来判定相应抗原或抗体，称为凝集试验。颗粒性抗原与抗体直接结合后出现的凝集现象，称直接凝集试验。 将可溶性抗原或抗体先吸附于一种与免疫无关的，一定大小的载体颗粒表面，然后与相应抗体或抗原作用，在适宜的条件下由于抗原抗体的特异性结合，会带动载体颗粒的凝集，出现肉眼可见的凝集现象，称间接凝集试验。 常用的载体颗粒有红细胞（“O”型人红细胞，羊红细胞）