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酶免疫技术 Enzyme Immunoassay 免疫标记技术是用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应 荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定 敏感性、特异性、精确性及应用范围 免疫荧光技术 放射免疫技术 免疫酶技术 免疫电镜技术 免疫胶体金技术 发光免疫测定 酶免疫技术Enzyme Immunoassay（EIA） 抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 （一）基本原理 酶标记抗体或抗原： 抗体或抗原的免疫学反应特异性 ＋ 酶活性 酶是一种有机催化剂： 使底物基质水解而呈色 使供氢体由无色还原型变为有色氧化型 ∴ 可用呈色反应显示酶的存在。 　　很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。 （二）常用的酶及其底物 酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。 常用酶 底物 显色辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2 橙黄色 四甲基联苯胺、 H2O2 蓝色碱性磷酸酶 对硝基本磷酸脂 黄色 （三）标记方法 酶结合物 技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。 戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶 改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG （四）酶标记物的纯化及鉴定 1、纯化 游离酶：增加非特异染色 游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色 葡聚糖凝胶层析法 50%饱和硫酸铵沉淀提纯法 2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法 （五）固相酶免疫测定仪（酶标仪） 比色 测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样 450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm （六）类型 酶免疫组织化学技术：检测组织或细胞中抗原或抗体 酶免疫测定：用酶标记抗原或抗体做标记物，检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。 根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标记物分离，分为均相和异相 均相：酶标抗原+非标记抗原+限量抗体，酶标记物发生抗原抗体反应后，酶活性减弱或增强。 异相：反应后，分离形成复合物的酶标记物并检测。根据是否采用固相材料以吸附抗原或抗体分为液相和固相。 液相：待测抗原+酶标抗原+抗体，一次性温育 待测抗原+抗体，温育，加酶标抗原，温育 固相：固相预先吸附抗原或抗体，在其表面反应 (酶)免疫组织化学（免疫细胞化学）：指带显色剂（酶）标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原或抗体进行定性、定位、定量测定的技术。 免疫反应特异性 组织化学的可见性 免疫组化技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于荧光免疫组化技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的酶免疫组化技术。 荧光免疫组化技术局限性：荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清 酶免疫组化技术：能克服上述不足，且敏感性更高，对石蜡切片标本尤为适用，酶显色产物具有较高的电子密度，可用电镜观察。 步骤： 抗原的提取与纯化 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化 标记抗体 标本处理 抗原抗体反应和呈色反应 显微镜观察 标本 取材新鲜、固定及时、形态保存良好、抗原性不被破坏 活体组织切片或印片 各种体液、穿刺液（细胞沉淀涂片） 培养细胞 1 标本的固定与保存： 固定使细胞内蛋白凝固，终止胞内酶活化，防止细胞自溶，保存抗原性 固定剂：乙醇、丙酮、戊二醛等 切片：冰冻、石蜡 2 酶消化：打开固定过程中由于醛键形成而被封闭的抗原决定簇（胃蛋白酶等） 3 免疫染色 标记抗体与标本中抗原反应形成复合物，洗去未结合成分，直接镜检。 对照试验（control）： Positive：已知抗原阳性的切片 Negat