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酵母双杂交系统 Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 用途：研究活体内蛋白质相互作用 原理： 需要条件 BD-plasmid， AD-plasmid，内源性Gal4失活，选择标记 需要条件 报告基因：HIS（合成组氨酸） 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 筛选存活选择 在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培养基上筛选双载体转化子。 筛选蛋白相互作用的选择 在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选能相互作用菌落 酵母双杂交实例——我们的研究 诱饵载体的构建和自激活 小鼠脑cDNA文库 的筛选 1.扩增、纯化小鼠脑cDNA文库的质粒DNA，与pGBKT7-基因X 质粒共转化酵母AH109， 在SD/-Trp-Leu-His-Ade平板，得到105个单克隆。 2.检测了这105个单克隆β-半乳糖苷酶基因的表达，共有20个克隆呈蓝色(即表达β-半乳糖苷酶基因) 阳性克隆的鉴定 1.从上述得到的20个阳性克隆提取质粒，测序 2.在NCBI进行blast,将有意义的文库质粒与诱饵质粒再次转化酵母AH109，只有带有ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide （ATP1B1）序列的文库质粒仍能在SD/-Trp-Leu-His-Ade上生长，且能表达LacZ基因。 荧光共定位验证蛋白相互作用 免疫共沉淀流程图 免疫共沉淀验证蛋白相互作用 RNAi沉默基因X检测ATP1B1及AD相关基因的表达 1. ATP1B1是ATPase的一个组成部分，具有组织特异性，能调控alpha亚基，且有文献表明它与AD(阿兹海默病）相关基因BACE1有相互作用 1. psiRNA-基因X:能转录出带有发夹结构的RNA，特异性沉默基因X psiRNA-基因X-CK:含有无关序列，作为阴性对照、 psiRNA:空载体 分别转染c17.2细胞 2. 转染72小时后，做Realtime PCR，分别检测beta actin,基因X,ATP1B1,BACE1 这4种基因的表达, 以beta actin作为基准，用ΔΔct法计算，psiRNA-基因X沉默组，psiRNA-基因X-CK打乱序列组相对于psiRNA空载体组的基因表达量 利用荧光素酶系统研究DCF1启动子 结论总结 1：利用酵母双杂交技术，以DCF1为诱饵蛋白，在小鼠脑cDNA文库成功筛选到了与DCF1相互作用的蛋白，ATP1B1，并用荧光共定位和免疫共沉淀进一步证实了它们的相互作用 2：利用RNAi技术，沉默DCF1，研究ATP1B1和AD相关基因BACE1的表达变化，结果显示DCF1被抑制后ATP1B1和BACE1的表达也出现了大幅下调 3：将多个DCF1 5’侧翼序列的缺失体构建到荧光素酶报告基因pGL3中，分别检测它们的荧光素酶活性，初步检测出DCF1基因5’侧翼序列中具有启动子功能的片段及预测了相应片段中决定转录调控效率的转录因子。 讨论与展望 随着DCF1的下调，ATP1B1与BACE1的表达也出现了大幅的下调。揭示了DCF1与ATP1B1和BACE1还存在着反馈抑制或调控的关系，然而这只是mRNA层面上的变化。蛋白层面上的变化还有待于进一步的研究。 阐明DCF1与BACE1的关系，有助于了解DCF1在神经系统中的功能和AD发生发展的分子机制，并有可能使DCF1成为AD治疗的新的药物作用靶点 DCF1启动子的分析揭示了DCF1的转录调控机制是复杂的，它的表达受到多种转录因子的调节，若能进一步明确是哪个转录因子在何时作用于DCF1启动子，对于回答DCF1的时空特异性表达现象具有非常重要的意义 * * 学生：吴翌鎏 导师：文铁桥 GAL4 ：转录激活因子，含DNA结合功能域 (DNA binding domain，DNA-BD)和转录激活结构域(activation domain，DNA-AD) UAS： upstream activating sequence，是DNA-BD的结合区域 只有当被分开的BD、AD在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4 转录因子活性，启动基因表达 P: ADH1启动子 T: ADH1终止子 BD-plasmid 筛选标志：TRP ADH：Alcohol dehydrogenase 核定位信号是GAL4本身的一部分 AD-plasmid P: ADHI启动子 T: ADHI终止子 筛选标志：LEU2 核定位信号是SV40的T抗原的序列 双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。 Trp- Leu- His-