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限制性内切酶片段长度多态性Restriction Fragment Length Polymorphism 一 基本原理 RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。 限制性核酸内切酶（restriction end nuclease）能够识别DNA双链上特异的碱基序列并能 将之切断。不同的限制性核酸内切酶有各自特异的识别序列。 在同源染色体相应的DNA区段 ，用一种限制性核酸内切酶消化，由于碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段，然后 用标记好的相应的DNA探针与这些片段杂交，显示出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列 组 成是否存在差异。 这一技术的基础是通过限制性核酸内切酶切片段长度多态性来揭示DNA碱 基序 列组成的异同，因而称为限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorp hism，缩写为RFLP）技术。 二 RFLP技术的基本步骤   这一技术主要包括三大步骤： 　　1、靶DNA的准备 先将基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性核酸内切酶酶解基因组DNA， 将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳分离，使其按片段的长短排列，将DNA片段变性后转移至硝酸纤维膜或尼龙膜上，称印迹（Southern b1ot）转移，并在80℃烘烤 或用长波紫外线照射，将DNA固定在膜上。 　　 2、核酸探针的标记 将准备作为探针的DNA片段纯化（这些DNA片段可以是基因组DNA的 一个片段，或是cDNA，或是人工合成的寡核苷酸），用放射性元素（如α－32p）或非放射 性元素（如Dig－dUTP等）标记，经纯化后再用。 探针的获得最先用内切酶处理植物的 DNA获得DNA片段，再将其重组到质粒上，使它能插人细菌寄主细胞并在里面进行复制，通过稀释繁殖，每个菌落一般由携带某一段 DNA的细菌繁殖而来，这种在细菌细胞中扩增、纯化DNA 片段的过程称做DNA克隆,这—系列的克隆经放射性同位素标记就成了一系列的探针。　 3、杂交显示 将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链核酸杂交，洗膜去除未杂交 的标记探针后，进行放射自显影或加入酶的底物进行显色反应，再对显示出来的谱带进行分 析。 三 RFLP技术的应用实例 1. paternity Case Lets use RFLP technology to determine if Jack is the father of Jills child named Payle. In this scenario, DNA was extracted from white blood cells from all three individuals and subjected to RFLP analysis. The results are shown below: 2.Disease Status RFLPs are known for CF?囊性纤维化(属遗传性胰腺病) and so it would be easy to determine if a person were homozygous wild-type (wt), heterozygous carrier, or homozygous disease alleles and thus have CF. if both parents were heterozygous, they could have children with any of the three genotypes, though heterozygous children would be twice as likely as either of the homozygous genotypes. 3. Genetic Mapping To calculate the genetic distance between to loci, you need to be able to observe recombination. Traditionally, this was performed by observing phenotypes but with RFLP analysis, it is possible to measure the genetic distance between two RFLP loci whether they are a part of genes or not. In this example, 70