外周血培养及核型分析.pptVIP

* * 综合性实验 外周血培养及核型分析 细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。 Moorhead和Levan等(1960)建立的人体外周血淋巴细胞培养技术，以及Rothrels等(1958)建立的气干法制片技术，成了研究人与哺乳类染色体的最主要技术。 一、实验目的和要求 1、 掌握无菌操作的原理和方法； 2、 掌握外周血培养的原理和方法； 3、 掌握显微摄影和图象分析的原理和方法； 4、 掌握外周血淋巴细胞染色体制备的技术; 5、 综合运用已掌握的知识基础和已具备的 实验能力，提高科学研究的综合素质。 二、实验原理 细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。 外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形状而利于辨认。 染色体标本制备过程中有两个重要环节， 原理如下： (1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细固定质量及标本质量。 (2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。 三、实验用品 (1)器材：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、超净工作台、无菌培养瓶、10ml离心管、显微摄影装置。 （2）试剂：RPMI 1640或Eagles MEM培养液、小牛血清(FCS)、PHA、秋水仙素、O．075M KCl、甲醇、冰醋酸；肝素、Giemsa、pH6．8的PBS。 （3）材料：动物外周血 四、实验方法（实验操作要点） (1)采血：用肝素润湿注射针筒(0.2m1)后，常规取静脉血约1～2ml，转动针筒混匀肝素。 （2)接种(在超净工作台中无菌操作)：在每个培养瓶中(含20％血清的1640培养液5ml，pH7．2)，加入全血O．25～O．30ml(7号针头13～15滴)、PHA 5mg，盖紧胶塞，轻轻摇匀后。 （3)培养：将培养瓶放在37℃恒温培养箱内培养72 h。终止培养前2～4 h，加入O·01％秋水仙素溶液(100μg／m1)1～2滴(7号针头)，使终浓度为0．2μg／ml培养液。轻轻摇匀后，放回培养箱继续培养2～4h。 (4)收获：将培养后的血细胞收集在离心管中，平衡后1 000r／min离心8 min，弃去上清。 （5)低渗：向离心管中加入37℃ 0.075 mol／L KCl溶液至8ml，用吸管轻轻吹打混匀细胞，置于37℃水浴箱温育15 min。 （6)预固定：向离心管中滴加新配制的甲醇一冰醋酸固定液1～2 ml，用吸管轻轻吹打混匀后1000r／min离心8min，弃去上清。 (7)固定：加入新配制的固定液至8 ml，室温静置30 min。1 000 r／min离心8min，弃去上清。可再重复固定1次。 （8)制片：根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液(O．5～lml)，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴至冰冷的载玻片上，立即甩口。吹散，酒精灯火焰过一下，冷风吹干或气干。 (9)染色：1：10 Giemsa染液(pH 6．8)染色10～20 min。流水冲洗，晾干，镜检。 （10）摄影分析：选好的分裂相进行显微摄影，并用图象分析软件进行核型分析。