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第六章 核 酶（Ribozyme) 一、概述 二、剪接型核酶 三、剪切型核酶 四、核酶的应用 五、核酶技术面临的问题 六、脱氧核酶（deoxyribozyme) 3、核酶作用的特点 化学本质 RNA 底物 RNA 肽键 ā-葡聚糖分支酶 反应特异性(专一性）碱基 催化效率 低 产物 二、剪接型核酶 剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方式除去内含子（Intron). 剪接型核酶分类 1、I类内含子 2、II类内含子 1. I类内含子的自我剪接(Self-splicing) 剪接机制 L-19IVS在体外的多种酶活性 核酶是一种金属依赖酶 结构与功能的关系 引导序列：IVS中的6个嘌呤核苷酸序列 5‘CUCUCU3’ 3’GGGAGG5’ G结合位点:IVS 中的 P7茎区 空间结构 核酶是一种金属依赖酶 金属离子的作用： 1、特异的结构作用，或参与活性部位的 化学过程 2、促进RNA的总体折叠 3、二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形成 2、Ⅱ类内含子的自我剪接 剪接机制 结构与功能的关系 三、剪切型核酶 1、自身催化剪切型RNA 1、1 剪切机制 1、2 结构与功能的关系 锤头结构 (Hammerhead) 发夹结构(Hairpin) 斧头结构(Axehead) 假结样结构(Pseudoknot-like) 1、3 影响核酶活性的因素 锤头（Hammerhead)结构 二级结构模型 锤头二级结构编号 锤头结构的类型 锤头核酶的催化反应机制 发夹（hairpin ）结构 发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链，英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链RNA。 发夹核酶结构模型 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。 影响核酶活性的因素 1、pH值对活性的影响 pH7﹒0 - 7 ﹒5 时核酶活性最高。 2、二价金属阳离子对活性的影响 Mg 2+ Mn 2+ 3、抗生素对活性的影响 大多数为抑制效应 4、变形剂对活性的影响 5、温度对活性的影响 在65℃范围内随温度升高而增加，37 ℃时均有适宜的活性。 锤头结构的 五种类型 R示酶，S示底物，箭头示剪切位点 建议的L19 RNA催化机理 锤头型核酶对切割位点的识别位点遵守NHH规则（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）。催化过程需要二价金属离子参与。 单金属离子催化 双金属离子催化 锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图 三个双螺旋区 13个核苷酸残基保守序列 剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发生 UCUAAA IVS GUAA Pre-rRNA UCU A A A GUAA UCUoH3’ 5‘GAAA GUAA UCUUAA 5’GAAA GOH 3’ G-IVS L-19IVS 19nt 5‘ 3‘ rRNA 5‘ 3‘ 5‘ pGOH 3‘ 5‘ 3‘ 四膜虫rRNA前体自我剪接反应 CCCUCU O P + HOG 3’ OA o o o CCCUCU O P OA o O G CCCUCU OH + P-oG o Ao o 过渡态 CCCUCU O P OA o O G o CCCUCU O P OA o O G Mg 2+ Mg 2+ o 过渡态 金属离子催化 17位（ X ）的核苷酸残基多数是C,不能是U,G. 7位核苷酸残基的置换不会对酶活性产生很大影响 锤头二级结构编号 7位核苷酸 17位核苷酸 GUACGGCCGGU GCCGGCUGGGG CAUU CCGAGGGGAC CAA GUAAUGGCUCCCCUG c CGG GUCCA