产植酸酶黑曲霉菌株S8的基因扩增与鉴定.doc

产植酸酶黑曲霉菌株S8的基因扩增与鉴定 曾 秀1，郭万柱2，孔路军1，王孝友1 （1.重庆市养猪科学研究院，重庆 荣昌 402460；2.四川农业大学动物科技学院，四川 雅安 625014） 摘要：本文主要报道了用三种不同方法从S8黑曲霉菌丝体中提取基因组DNA，最适方法是经改进的Vitagene试剂盒法。PCR扩增效果最好的是设计时没有去掉phyA基因内含子的引物，获得的特异性PCR产物长约1.5kb。同时对PCR反应体系进行了优化。对扩增出的目的片段用三种不同方法进行纯化回收，结果是PCR Fragment Recovery Kit法回收效果最好，其产量可达到约10ng/μL。根据已报道的植酸酶sPhyA基因序列酶切位点，对回收的目的片段进行酶切鉴定，该基因能被BamHⅠ、SalⅠ酶切，不能被HindⅢ、XbalⅠ、KPnⅠ酶切，与已知的phyA基因酶切图谱基本一致，进一步判定PCR扩增产物中含有植酸酶phyA基因。 关键词：植酸酶；PCR；PhyA基因；酶切分析 植酸（phytic acid）即肌醇六磷酸，是植物种子中肌醇和磷的主要存在形式，60%~80%的磷以植酸盐的形式存在，但这些磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用，其利用率仅为0~40%，从而造成了一系列问题：首先是造成磷资源的浪费，提高了饲料的成本；其次是不被消化吸收的有机磷粪便严重污染环境；另外，因植酸磷络合某些营养物质，被认为是抗营养因子。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或盐）的一类酶的总称。在饲料中添加植酸酶可降解植酸盐释放无机磷，提高动物对植酸磷的生物利用率，缓解植酸盐的抗营养作用。 植酸酶作为单胃动物的一种饲料添加剂，其饲喂效果已在世界范围内得到广泛的确证。但因为植酸酶在天然材料中表达水平太低，且它的一些酶学性质（如耐温性、pH适性、催化活性等）不适应饲料加工和养殖业的实际要求，所以植酸酶的应用受到一定的限制。近年来，随着分子生物学的兴起以及饲料工业的发展，植酸酶的分子生物学研究成为世界性的研究热点。 本试验对自行分离鉴定的植酸酶高产、稳产菌株S8进行了模板DNA的制备、PCR引物的筛选、PCR反应条件的优化、目的片段的回收与酶切图谱分析鉴定，这为植酸酶基因在适宜载体里的构建与表达提供了试验材料和理论依据。 1.材料和方法 ⒈⒈试验材料 试验用菌株S8：为本试验室自行分离鉴定和保存。 主要试剂：产酶培养基（1.5%葡萄糖、0.3%蛋白胨、0.2%（NH4）2SO4、0.05% MgSO4.7H2O、0.05% KCl、0.003% FeSO4.7H2O、0.003% MnSO4.4H2O）；小量基因组纯化试剂盒（Vitagene Genomic DNA Mini-prep）；PCR试剂盒（Promega）；PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A.Gel Extraction Kit）；引物(上海生工合成)；低熔点琼脂糖(进口)；限制性内切酶（BamHⅠ、SalⅠ、HindⅢ、XbalⅠ、KpnⅠ）；溶菌酶；蛋白酶；核糖核酸酶（Rnase）等。 主要仪器：梯度PCR仪(German)、电泳凝胶图像分析系统（Italy）、空气恒温震荡器（HZQ-C）、电泳装置(北京)、冷冻离心机（universal 32r）、超纯水系统(Labconco)、霉菌培养箱（MJX-250Ⅱ，广东）、微量移液器（Japan）、紫外透射仪(Italy)。 ⒈⒉ 实验方法 ⒈⒉⒈ 黑曲霉菌丝体的培养 挑取黑曲霉孢子接种在装有5mL产酶培养基的试管内，在空气恒温震荡器中30℃振摇培养48h；将25μL浓孢子悬液接种在装有50mL产酶培养基的100mL三角瓶里，振摇培养72h；将培养物过滤，然后用10%甘油洗涤菌丝体两次⑴。收集菌丝体于 1.5mL离心管中，置于液氮里保存，以备提取染色体DNA所用。 ⒈⒉⒉ 样品的预处理 称取1g黑曲霉菌丝体（湿重），用一端磨细（以能到达1.5ml离心管顶端的细度为宜）的玻璃棒反复研磨、冻融，至少10次以上。 ⒈⒉⒊ 黑曲霉细胞中染色体DNA的提取 方法一：酚/氯仿抽提法怎么减肚子 参照《精编分子生物学试验指南》⑵。 方法二：溶菌酶法 参照《工业微生物实验技术手册》，方法略有改动⑶。 方法三：改进的泛特津（Vitagene）试剂盒法 参照泛特津小量基因组DNA纯化手册（ Vitagene Genomic DNA Mini-prep Handbook），方法略有改动。 ⒈⒉⒋电泳观察DNA提取结果 取5μL洗脱的DNA在1.2%低熔点琼脂糖凝胶上电泳检测DNA质量和数量。 ⒈⒉⒌　PCR引物的设计 在NCBI基因文库中下载黑曲霉植酸酶phyA的基因序列（Accession:AB022700、AE00