（铜螯合亲和层析分离抗氧化活性蚕豆蛋白酶解物.docVIP

(铜螯合亲和层析分离抗氧化活性蚕豆蛋白酶解物 李雪芬1 韩涛1 * 夏晓楠1 丁轲卞科2河南工业大学，郑州450052）pH 5.0，浓度为0.05 mol / L的NaAc-HAc；上样量为20 mg/mL的蚕豆蛋白酶解物1 mL；洗脱剂为0.04 mol /L咪唑。洗脱得到不能螯合铜的蚕豆蛋白酶解物组分F1及能螯合铜的组分F2，测定其总还原力、抑制羟自由基能力与铜螯合量，发现抗氧化活性的关系为F2 蚕豆蛋白酶解物F1（p0.05），铜的关为F2 经F1（p0.05）,表明蚕豆蛋白酶解物的铜 蚕豆是一种重要的植物蛋白资质质约2535％。我国积总产国饲[1]。目前食品加工业产丝质肽[2]。 体内属铜铁对电为Fenton应剂产来够结铜铁断产实现[3]。近年来质酶肽属肽能钙鹰酶铜β-胡萝卜素的氧化[5]。其它如大豆蛋白[6]、猪加鳕鱼证属证属肽组这提吲哚基巯团时N、O或S等能参 [10-14]。蚕豆蛋白中组氨酸含量为2.24%～2.71%，谷氨酸15.80%～19.41%，天门冬氨酸12.36%～14.36%[15]，有螯合金属离子的可能性。但目前有关蚕豆的研究多集中在蚕豆蛋白的提取及其酶解工艺的确定上[1,2,15,16]，从蚕豆中提取分离铜螯合肽并测定其抗氧活性的研究尚未见报道。 金属亲层( Immobilized Metal Affinity Chromatography，IMAC)是一种很好的蛋白质和多肽纯化技术，其高选择将属肽开广应[17]。本文采用金属亲层将铜肽进铜间关1 材料与方法 1.1 材料与试剂干蚕豆：市售；碱性蛋白酶（活性≥20 000 U/g）：北京奥博星生物有限责任公司；FLF01 Folin-试剂国术责Ni-琼胶6FF层辉羟测试剂:南京建成生物工程研究所；其它试剂为学纯1.2仪设备SJ-5 pH 计:LGJ-18型冷冻冻: 北京四环学仪Anke TDL-40B离心机: 上海安亭科学仪; T6新世纪见计计:仪责;B260-恒温锅: 亚荣仪HL-2S恒流泵：上海沪仪1.3 试验方法 1.3.1 样备称12 h，去壳，0.5%的Na2SO3和0.01%的NaOH混合溶液浸泡12～16 h，45 ℃干燥，粉碎过60筛称g/mL）1∶15加入蒸馏搅2 mol/L NaOH溶液调节pH 8.0，50 ℃浸提60 min,浸提液经4 000 r/min10 min离心，用2 mol/L HCl调电点4.2，静0.5 h,搅匀3 000 r/min离心15 min，收集沉淀物，水洗两将调搅冻为 3%(w/v)的比例溶于水中，将pH用2 mol/L NaOH（或HCl调节)调至9.0，温度调至65 ℃，加入碱性蛋白酶（酶底比：16 000 U/g）在此温度下水解4 h，待反应结束后，在100 ℃水浴中灭酶10 min。冷却温( 3 000 r/min，20 min) 收集上清液即为酶冻冻备 1.3.2肽含量的测定 采用Folin-酚蛋白定量试剂进测肽计( BSA) 作标 1.3.3 抗氧化活性指标的测定 1.3.3.1 总还原力的测定 取样2 mL，加入2 mol /L pH 6.6 的磷酸盐缓冲2 mL 1%的铁钾50 ℃下加热20 min2 mL 10%的TCA，混合。混合物离心( 3000 r，10 min) 。取上层2 mL加入2 mL 蒸馏0.4 mL、0.1%的FeCl3，三者充分混合。反应10 min700 nm下测馏为对肽还U( 样对) 表示[18]。 1.3.3.2羟 采用羟试剂测样羟1.3.4 金属亲层 将IDA-Sepharose 6B( 25 mL) 装入柱（2.6×10 cm）40 mL 0.2 mol /L CuSO4螯合铜离子30 min [铜螯合量为( 93.5 ±2.2) μmol /mL湿胶，( 467.6±3.6) μmol /g 干胶] 。柱子经8～9倍床体积的去离子水清洗，平衡缓冲液平衡。蚕豆蛋白酶解物冻干粉20 mg 溶解在1 mL平衡缓冲溶液，上样，静止30 min.。平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液体命名为未吸附的组分F1。结合到铜柱上的蚕豆肽分别采用不同的洗脱剂洗脱，收集洗脱液命名为F2。洗脱过程流速为1 mL /min，紫外检测仪检测吸光值，室温。柱子的再生: 5～10倍柱床体积的0.05 mol /L的EDTA洗柱，后用纯净水流洗5～10个柱床体积，流速为1 mL /min。 1.3.4.1不同pH 平衡缓冲液对蚕豆肽吸附能力的影响 蚕豆肽吸附试验所用的缓冲液: ( A) 缓冲液为0.05 mol/L 的NaAc-HAc、pH 5.0; ( B) 缓冲液为0.05 mol/的NaAc-HAc、pH 5.5；（C）0.05 mol/L的2-吗啉乙磺酸［( 2-