3基因工程载体辩析.pptVIP

3 基因工程载体 3.1 质粒载体 3.2 λ噬菌体 3.3 单链DNA噬菌体 3.4 黏粒载体 3.5 其他载体 3.6 表达载体 载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，它的本质是DNA复制子。 作为载体必备的3个基本条件： I 能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制 II 具有合适的限制性酶切位点 III 具有合适的选择标记基因 3.1 质粒载体 质粒：染色体外能自我复制的小型DNA分子。 广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中。 大小1Kb-200Kb。 携带基因，可以赋予宿主某些生物特性： 抗生素抗性、降解复杂的有机物、产生限制酶和修饰酶等。 3.1.1质粒的一般特性 （1）质粒的分子特性 （2）质粒的复制类型 （3）质粒的不亲和性 （4）质粒的转移性 （1）质粒的分子特性 绝大多数是双链闭合环状DNA分子。 具有三种不同构型： ccDNA：闭合环状DNA，呈SC构型； ocDNA：开环DNA，呈OC构型； lDNA：线形DNA，呈L构型。 （2）质粒的复制类型 严谨型质粒：拷贝数较少，1-3个拷贝；受宿主染色体DNA复制的严格控制。 松弛型质粒：拷贝数较多，10-200个拷贝，有时可达700个拷贝。 （3）质粒的不亲和性 质粒的不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同的质粒不能够在同一个宿主细胞系中稳定的共存的现象。 不亲和群：将具有不亲和性的质粒划为一类，称为一个不亲和群。 （4）质粒的转移性 质粒的转移性：从一个细胞转移到另一个细胞的特性。 根据质粒是否带有控制细菌配对和质粒接合转移的基因，可分为： 3.1.2理想质粒载体的必备条件 具有较小的分子量和较高的拷贝数； 具有若干限制性内切酶的单一酶切位点； MCS：多克隆位点 具有两种以上的选择标记基因； 缺失mob基因 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。 3.1.3 质粒载体的构建 3.1.4 常用的质粒载体类型 (1) 克隆质粒载体 (2) 表达质粒载体 (3) 多功能质粒载体 (4) 穿梭质粒载体 (1) 克隆质粒载体 用于基因或DNA片段无性繁殖。 目前常用的克隆质粒载体有： pBR322、pUC、及其派生质粒。 α互补 pUC比pBR22更理想 更小的分子量； 利用组织化学法筛选重组体，方便省时； 具有多克隆位点； 拷贝数更多。 (2) 表达质粒载体 表达载体：专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。 表达质粒载体的特点： 具有强启动子； 具有核糖体结合位点（S-D序列）； 具有转录终止序列。 (3) 多功能质粒载体 具有多种功能，可以根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。 如pGEM系列质粒。 (4)穿梭质粒载体 穿梭质粒载体：由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。 常见的穿梭载体： 大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭载体、 大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体、 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体、 …… 3.2 λ噬菌体 λ噬菌体的基因组 3.2.2 λ噬菌体载体的构建 野生λ噬菌体不适合做载体： ① 基因组大而复杂，含有常用限制酶的多个识别位点； ② λ噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNA分子。 对λ噬菌体的改造以满足基因工程需要： ① 切除掉非必需区段，扩大载体容量； ② 除去多余的限制酶识别位点； ③ 引入适当的选择标记，以方便筛选； ④ 通过在某些必需基因引入无义突变使之称为安全载体。 3.2.3 常用的λ噬菌体载体 λ噬菌体载体的分类： 插入型载体：具有一个限制酶的识别位点供外源DNA插入。容量一般在10Kb之内。 β半乳糖苷酶失活：λgt11、λgt18～23、Charon2. 免疫功能失活：λgt10、λNM1149、Charon6、Charon7. λZAP插入型载体。 替代型载体：具有两个限制酶识别位点，它们之间的DNA区段可被外源DNA取代。容量为20Kb。 Charon系列：Charon32～35、Charon40、Charon21A. λEMBL系列：λEMBL3、λEMBL4、λEMBL3A. Spi-正选择取代型：λL47、λ2001、λEMBL. λZAP插入型载体 3.3 M13噬菌体 丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd。 DNA为单链环状,大小6.4Kb。 M13、f1、fd的DNA同源性较高。 编码10个基因。 含有少量间隔区：2和5之间，3和7之间。 3.3.1 M13噬菌体的生活史 3.3.