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生物工程上游技术实验综合实验设计 利用不同的方法筛选和鉴定转化子 生命科学学院 生工121 指导老师: 田长恩、周玉萍 摘要 本次实验我们小组通过含Amp的培养基初步筛选出转化子、菌落直接PCR、摇菌培养观察细菌表达形态等一系列实验方法，从6个转化子中筛选出了2个目的重组子.，从而达到实验的基本目的，基本掌握了转基因生物筛选鉴定的基本方法。 关键词 筛选、菌落直接PCR、摇菌培养、电泳 引言 在质粒载体上进行克隆时，由于重组质粒转化的大肠杆菌的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。首先，通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。然后，通过菌落直接PCR从转化子中筛选出候选转基因生物。最后，摇菌培养观察菌株表达形态。 通过抗生素抗性筛选，从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选，只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落。 通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物，扩增出特殊目的基因片段，判断所得转化子是否为重组子。但因为PCR技术的高灵敏性，往往会产生假阳性结果，所以有必要进一步进行鉴定.。从候选重组子中进行摇菌培养关注菌株表达形态，若出现荧光蛋白则说明菌株成功转化并表达了GFP荧光蛋白。 三、使用仪器、材料 1、材料：实验九准备好的菌株。 2、实验仪器及设备:PCR仪、恒温摇床、台式高速离心机、恒温水浴锅、琼脂糖凝胶电泳装置、电热恒温培养箱、电泳仪、超净工作台、微量移液抢、1.5mL离心管等。 3、主要试剂：10×PCR?buffer?、dNTP?mixture?、前向引物(P1)?、反向引物r(P2)??、?rTaq?酶?、灭菌蒸馏水、LB液体培养基： 实验步骤 转化子筛选：在实验九含有Amp的筛选培养基中长出的菌落中挑选出6个白色单菌落，并做好标记，这6个单菌落即为转化子。 菌落直接PCR：用无菌牙签把6个白色单菌落，先在编好号的6支PCR反应管中的底部分别涂擦，然后在PCR管中配制60μL反应体系.并按每管9μL分装好反应体系。反应体系如下:? DNA?template?buffer?????（用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹） ? 10×PCR?buffer??????????6μL? dNTP?mixture???????????4.8μL ? 前向引物(P1)????????2.4μL ? 反向引物r(P2)????????2.4μL ?rTaq?酶????????????0.2μL? 灭菌蒸馏水????????????????43.8μL? 所有试剂按量仔细添加后,轻轻混匀,稍离心即可.然后每支PCR涂抹反应管内分装9μL 为了防止反应混合液蒸发,最后添加15μL矿物油 PCR仪的参数设置? 94℃????4min? 94℃????30s? 61℃????30s??????? ?40?cycles? 72℃???50 72℃????5min? 琼脂糖凝胶电泳检测:? PCR反应结束后，往每只PCR反应管加入2μL的6×loading?buffer,稍离心混匀后从每支PCR管中取6μL产品点样,电泳15min.观察产物带。 配置LB液体培养基， 称胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g于1000ml的三角瓶中，加入1000ml蒸馏水搅拌溶解，然后用NaOH调pH至7.5，加塞，包扎瓶口。并把电泳结果中有荧光条带的4个样品分别接种到装有15ml培养液的锥形瓶中，然后将锥形瓶放置到摇床中过夜恒温培养，于第二天观察菌株生长情况。 实验结果及分析 1 2 3 4 5 6 （这是我们小组的6个样本） 图一 菌落直接PCR电泳图 结果分析：有电泳图中可以看出六个电泳样本中第1、2、3、4、6号泳带都扩增出特异性条带，表明这五个菌落的菌PCR结果为阳性，说明第1、2、3、4、6号菌是所需鉴定的重组子。我们选取了1、